细胞成球实验（Spheroid Formation Assay）是一种三维细胞培养技术，用于研究细胞的增殖、分化和肿瘤球形成能力。该实验模拟体内肿瘤微环境，特别适用于癌症研究和干细胞研究。
1. 实验设计
• 明确实验目的，例如研究肿瘤球形成能力、评估药物对肿瘤干细胞的影响或筛选基因操作对细胞成球能力的影响。
• 选择合适的细胞系，如癌症细胞、干细胞或肿瘤干细胞。
2. 细胞培养
• 将细胞在标准的培养条件下培养至对数生长期（通常使用含10%胎牛血清的完全培养基）。
• 用PBS洗涤细胞两次，去除浮游细胞和杂质。
• 使用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，收集细胞悬液。
• 通过离心（通常为1000 rpm，5分钟）收集细胞，并用PBS或培养基重悬。
• 计数细胞浓度并调整至合适密度（如每毫升1×10^3至1×10^4个细胞）。
3. 接种细胞
• 低粘附性培养板：使用低粘附性96孔板，每孔接种100-200 µl的细胞悬液。每孔的细胞数通常为100-1000个。
• 悬滴培养法（可选）：在培养皿盖子上点滴悬滴（通常为20-50 µl，包含500-1000个细胞），将培养皿倒置在含有无菌水的培养皿中，以保持湿度。
• 确保细胞在孔内均匀分布，避免堆积。
4. 细胞成球培养
• 将接种好的培养板置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育。
• 使用无血清培养基或低血清培养基，添加特定的生长因子（如EGF，FGF）以促进球体形成。
• 孵育时间通常为3-7天，视细胞类型和实验设计而定。
• 定期检查培养情况，如果培养基蒸发可轻轻补充培养基，避免直接滴加到细胞球上。
5. 显微镜观察
• 使用倒置显微镜在不同时间点（如1天、3天、7天）观察细胞球的形成。
• 记录细胞球的形态、大小和数量，拍摄图像以便后续分析。
• 注意：成球的效率和球体的形态可能因细胞类型和培养条件而异。
6. 数据分析
• 球体数量和大小测量：使用显微镜和图像分析软件（如ImageJ）计算每个孔中形成的球体数量和直径。
• 形态分析：评估球体的形态，注意球体的均匀性、致密性和边缘清晰度。
• 统计学分析：将实验组与对照组进行比较，分析药物、基因操作或其他处理对细胞成球能力的影响。使用统计学方法（如t检验、ANOVA）确定结果的显著性。
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