TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)技术是一种检测细胞凋亡的方法。该技术基于终端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记的dUTP掺入断裂的DNA链3'末端来检测DNA片段化,是检测细胞凋亡的经典方法之一。
以下是TUNEL检测的基本流程:
1. 实验设计
• 明确实验目的,如检测特定处理(如药物、基因操作、放射处理)对细胞凋亡的影响。
• 选择合适的细胞系(如癌细胞、神经元、成纤维细胞等)或组织样本。
• 确定实验组和对照组,例如药物处理组、阳性对照组(已知诱导凋亡的处理)和阴性对照组(不处理或只加溶剂)。
2. 细胞/组织准备
• 细胞培养:将细胞培养至对数生长期,确保细胞状态健康。根据实验需求,将细胞种植于合适的培养皿或多孔板(如24孔板、6孔板等)中。
• 组织样本:对于组织切片样本,使用福尔马林固定组织并通过石蜡包埋,切片厚度一般为4-6微米。
3. 处理和诱导凋亡
• 按实验设计,加入诱导凋亡的药物或其他处理方式(如紫外照射、放射处理、化学药物)。
• 设定合适的处理时间,根据具体药物或处理方式可能需要数小时到数天。
• 对照组设置阳性和阴性对照,阳性对照可以使用已知的凋亡诱导剂(如staurosporine)。
4. 固定和穿透
• 处理结束后,去除培养基,使用PBS(磷酸盐缓冲液)轻轻洗涤细胞或组织切片两次。
• 细胞固定:加入4%多聚甲醛(PFA)溶液,室温下固定细胞10-30分钟。
• 组织切片固定:若使用冰冻切片或石蜡切片,切片制备好后可直接用于固定。
• 固定后,使用PBS洗涤两次。
• 穿透处理:加入0.1% Triton X-100和0.1%柠檬酸钠混合液,室温下处理5-10分钟,以增加膜的通透性。
5. TUNEL染色
• 准备TUNEL反应混合物:按照试剂盒说明书,将TdT酶与标记的dUTP(通常是FITC-dUTP或BrdU-dUTP)按比例混合。
• 去除PBS,加入TUNEL反应混合物,覆盖细胞或组织切片。
• 在37°C孵育30-60分钟,避免光照(使用避光的湿盒进行孵育)。
• 孵育结束后,PBS洗涤3次,每次5分钟。
6. 染色和封片
• 对细胞/切片进行DAPI染色(或其他细胞核染色剂),以便区分细胞核并检测总的细胞数。
• 加入适量的DAPI染色液,室温避光孵育5-10分钟。
• 用PBS洗涤两次。
• 在组织切片上滴加抗荧光淬灭封片液后,盖上盖玻片,封片并固化。
7. 显微镜观察
• 使用荧光显微镜观察标记细胞。TUNEL阳性细胞显示绿色荧光(FITC),细胞核染色显示蓝色(DAPI)。
• 拍摄显微照片,并记录每个视野下的TUNEL阳性细胞数和总的细胞数。
地址:江苏省常州市中国科学院遗传研究中心 | 咨询热线:15189799066 | 销售咨询邮箱:sales@cellecx.com
技术支持邮箱:support@cellecx.com | 售后服务邮箱:service@cellecx.com
Copyright © 2024 江苏知源解码生物科技有限公司 All Rights Reserved. | 技术支持:互邦网络
地址:江苏省常州市中国科学院遗传研究中心
咨询热线:15189799066
销售咨询邮箱:sales@cellecx.com
技术支持邮箱:support@cellecx.com
售后服务邮箱:service@cellecx.com
Copyright © 2024 江苏知源解码生物科技有限公司 All Rights Reserved.
技术支持:互邦网络