平板克隆形成实验是一种用于评估单个细胞的增殖和集落形成能力的常用方法。该实验广泛用于研究细胞的转化能力、增殖潜力、药物敏感性等。
以下是平板克隆形成技术的基本流程:
1. 实验设计
• 明确实验目的,如评估细胞增殖能力、药物或基因操作对细胞增殖的影响。
• 选择合适的细胞系(如癌细胞系或正常细胞系)。
• 确定实验组和对照组,例如药物处理组、基因过表达/沉默组和未处理的对照组。
2. 细胞准备
• 细胞培养:将实验所需的细胞培养至对数生长期,确保细胞状态健康。
• 细胞计数:使用细胞计数仪或台盼蓝染色法计数细胞,确保细胞数量足够且活性良好。
3. 细胞接种
• 在6孔板、12孔板或更大的培养皿中接种细胞。通常,每个孔或培养皿接种200-1000个细胞,具体数量取决于细胞类型和实验设计。
• 轻轻摇动培养板以均匀分布细胞,使其单独分散在培养基中。
4. 培养与加药处理
• 将接种后的细胞培养板放入培养箱中(通常设定在37°C,5% CO2)孵育1-2周,具体时间视细胞增殖速度而定。
• 如需检测药物或其他处理对克隆形成的影响,在接种细胞后24小时内加入相应的药物或处理物质,并维持一定的浓度。
• 定期更换培养基(如每2-3天一次),以提供足够的营养和保持环境的稳定。
5. 克隆形成观察
• 在显微镜下定期观察细胞生长情况,监测克隆(细胞集落)的形成情况。克隆通常是由50个以上的细胞组成的明显集落。
• 记录克隆的大小和数量,确保对比不同实验组间的差异。
6. 固定和染色
• 当克隆达到适当大小时(通常为1-2周后),弃去培养基,用PBS轻轻洗涤细胞两次。
• 加入4%多聚甲醛溶液固定细胞,室温下固定10-15分钟。
• 轻轻洗涤固定液后,加入染色液(如0.1%结晶紫染色液),室温下染色10-30分钟,直到克隆清晰可见。
• 用自来水轻轻冲洗去除多余的染色液,晾干培养皿。
7. 克隆计数与分析
• 在显微镜下观察并计数每个孔或培养皿中形成的克隆数量。
• 记录数据,计算克隆形成率(克隆形成率 = (形成的克隆数量 / 接种的细胞总数)× 100%)。
• 根据实验组和对照组的克隆形成率比较不同处理的影响。
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