血管形成是指从已有的血管网络中生长出新毛细血管的过程，在组织修复、伤口愈合、肿瘤发生和转移等过程中发挥关键作用。血管形成失调参与多种疾病的发病机制，如糖尿病视网膜病变、类风湿关节炎等。因此，构建稳定的体外血管形成模型，对于研究血管生成机制及药物筛选具有重要意义。
本期细胞学堂系统梳理血管形成实验，涵盖实验原理、操作流程及常见问题解析，为科研人员提供一套完整的参考方案。
一、血管形成原理
血管形成是以内皮细胞为核心，主要历经细胞激活、迁移、管腔形成及成熟稳定等阶段[1]。
01内皮细胞激活与响应
内皮细胞是构成血管内壁的单层细胞，具有迁移、增殖及基质重塑的能力。血管形成始于内皮细胞对外部信号的感知。在缺氧、创伤或肿瘤微环境中，周围组织细胞分泌VEGF等生长因子，这些生长因子与内皮细胞表面受体结合，激活相关信号通路，使内皮细胞进入活化状态。
02内皮细胞迁移
活化的内皮细胞从原有血管中脱离，沿生长因子浓度梯度定向迁移。此过程中细胞会分泌MMPs等蛋白酶降解细胞外基质，并伴随增殖现象，为新生血管提供细胞来源。
03血管结构成型
内皮细胞迁移聚集后会相互连接、发生管腔化，形成具有内腔的血管结构。该过程依赖于细胞重排及极性建立，细胞间连接对维持结构稳定性至关重要。
04血管成熟与稳定化
新生血管的结构较为脆弱，需进一步成熟。内皮细胞与周细胞、平滑肌细胞相互作用增强血管壁结构。同时，新生血管与原有血管网络连接建立稳定血流，最终实现功能化。
血管形成实验基于内皮细胞在体外仍保留对血管生成相关信号的响应能力，以及快速迁移与增殖的特点建立。通过模拟基底膜微环境，将内皮细胞接种于富含细胞外基质成分的基质胶（Matrigel）上，细胞在数小时内发生迁移、重排并相互连接，形成类似毛细血管的网状结构。
可用于该体系的内皮细胞种类包括原代细胞、永生化原代细胞及细胞系。其中，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）来源稳定，对VEGF 等刺激响应敏感，体外可形成结构清晰、重复性良好的管状网络，是血管形成实验的经典模型[2]。
二、体外血管形成实验
血管形成实验的成功依赖于合理的实验设计与规范的操作流程。选用状态良好的HUVEC在基质胶体系中诱导其形成管状结构是关键。
实验设计与关键参数
实验前需核算培养基、凝胶基质、细胞用量等关键参数。不同孔培养板体系的推荐参数如下：
注：建议采用细胞密度梯度接种，并设置多复孔，以降低因密度不当而导致实验失败的风险。
操作流程（以 48 孔板为例）
01基质胶铺板
●实验前24 h：
将基质胶置于冰盒中，放入 4℃冰箱缓慢融化。
将48孔板和200 μL枪头预先放入4℃冰箱预冷，枪头尖端可剪去3-5 mm，便于吸取粘稠的胶体。
●冰上操作：用预冷枪头轻轻混匀基质胶，每孔加入200 µL基质胶，避免产生气泡。
注意：枪头应垂直于内孔的正上方缓慢滴加，避免基质胶粘黏在侧壁上。
若孔底部没有铺满胶或明显分布不均，可轻轻晃动孔板，使基质胶均匀覆盖孔底。
02
凝胶固化
●将铺好基质胶的孔板置于37℃培养箱中孵育45- 60 min至完全凝固。
●凝胶过程中不要摇晃孔板，以防止凝胶表面不均匀。
●孵育时观察凝胶状态。若出现类似沙丘的隆起和沟壑，应适当延长静置时间，直至凝胶表面平整后再进行后续实验。
03
细胞制备与接种
●当HUVEC汇合度达70%-80%时，用胰蛋白酶消化细胞、离心、收集细胞。
●用细胞专用培养基重悬细胞并计数。
●按照6×104个细胞/孔的密度接种，设置三复孔。
●加样时保持枪头垂直在孔的上方，注意不要接触到孔底的凝胶，缓慢滴加细胞悬液，以免损伤凝胶层。
04
成管孵育与观察
将细胞于37℃条件孵育，约4 h后成管结构形成达到峰值，此时可进行图像采集或后续分析。
●0-1 h，细胞正在贴附，不要摇动平板或将其从细胞培养箱中取出。
●2-4 h：管状结构开始形成，在显微镜下观察平板时，不要在细胞培养箱外停留超过两分钟。
●超过18 h：管状结构通常开始降解，细胞进入凋亡阶段，整体收缩脱落。
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