根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短,可以分为瞬时转染和稳定转染。
1)瞬时转染(transient transfection):指将构建好的质粒通过某种方式导入到细胞内,外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平表达,但通常只持续几天,直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24~72h小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统和荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。目前,由于各种转染试剂的发明,哺乳动物细胞的瞬时转染已经用于生产具有适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。
2)稳定转染(Stable transfected):外源DNA既可以整合到宿主细胞中,也可能作为一种游离体(episome)存在,转染细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留转染的DNA。但通常只有单个或几个拷贝的外源性DNA整合至稳定转染基因组中,因此稳定转染基因的表达水平一般低于瞬时转染基因的表达水平。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很低,通常在用于转染的DNA构建体中纳入可筛选标记物,如来氨丙基转移酶(APH,新霉素抗性基因)、潮霉素磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
表1 瞬时转染和稳定转染的比较
2. 根据转染方式可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成,这对大分子物质来说是个不可透过的屏障,比如DNA和RNA的磷酸骨架,其也带负电荷。为了使核酸穿过细胞膜,研究人员开发了多种技术,大致分为三类:
化学方法---利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷。
生物方法---利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中。
物理方法---在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA。
然而,没有一种方法适用于所有的细胞和实验,理想的方法应根据细胞类型和实验需要进行选择,理想的方法应具有高转染效率,低细胞毒性和对正常生理学的影响最小,并且易于使用和可重复性等特点。
实验室使用较多的主要有化学介导中的脂质体转染(质粒转染)和生物介导中的慢病毒转染法。其中质粒转染操作简单,一般瞬时转染选择较多,但有些细胞系不容易转染,因此选择转染方式时一定要做足功课,亲身经历告诉我,千万不要图方便,否则转染效率简直崩溃。特别是养原代细胞的小伙伴,一点要认真选择!病毒转染一般具有能够稳定表达的优势,且其对原代细胞有较高的转染效率,其中更分为慢病毒转染,逆转录病毒转染和腺病毒转染,其中腺病毒转染可适合更为难转染的细胞,例如悬浮细胞、T细胞、raw细胞等难转染细胞。
地址:江苏省常州市中国科学院遗传研究中心 | 咨询热线:15189799066 | 销售咨询邮箱:sales@cellecx.com
技术支持邮箱:support@cellecx.com | 售后服务邮箱:service@cellecx.com
Copyright © 2024 江苏知源解码生物科技有限公司 All Rights Reserved. | 技术支持:互邦网络
地址:江苏省常州市中国科学院遗传研究中心
咨询热线:15189799066
销售咨询邮箱:sales@cellecx.com
技术支持邮箱:support@cellecx.com
售后服务邮箱:service@cellecx.com
Copyright © 2024 江苏知源解码生物科技有限公司 All Rights Reserved.
技术支持:互邦网络