1. 阳离子脂质体转染法

通过化学物质介导的转染基本都遵循相同原理：1）带正电荷的化学物质与带负电荷的核酸形成核酸/化学复合物。2）带正电的核酸/化学复合物粘附在带负电的细胞表面被细胞内吞。

阳离子脂质体表面带正电荷，能与带负电荷的核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂质体复合物。被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。但由于脂质体对细胞有一定的毒性，转化时间越长对细胞毒性越大，所以转染时间一般不超过24小时。

特点：脂质体转染法的优点是能够高效转染许多细胞系，适用于高通量筛选，并能够递送任何大小的 DNA 以及 RNA 和蛋白。此外，该方法既可应用于稳定表达，也可应用于瞬时表达，与其他化学方法不同的是，其可用于将 DNA 和 RNA 向动物和人体内转移；缺点是转染效率依赖于细胞类型和培养条件，因此，需要对每种细胞类型的转染条件和转染试剂进行优化。

实验步骤：将DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和转染试剂分别在不同的管中稀释→将两者混合形成混合物→将形成的混合物加入细胞中，脂质体的正电荷有助于帮助复合物粘附到细胞膜上→复合物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。

进行实验之前，请先规划好实验，一般细胞转染需要24h-72h，所以要充分了解细胞生长速度，计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认准备好所需试剂：无血清培养基，Lipofectamine转染试剂，以及DNA。

1）细胞铺板

（1）一般会选择复苏细胞传代3-4次（汇合率达到90%之前对细胞进行传代，不要长到100%）。

（2）如果提总蛋白，一般选择六孔板进行转染，因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug，一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。

（3）传代条件取决于所用的细胞系。对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK293)。对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)。

（4）转染当天，将细胞铺板。如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降，如果是简单细胞系的转染，可以直接在前一天晚上铺板，第二天来转染。转染时，细胞密度会影响转染效率，细胞密度保持在汇合率为70-90%（这个前提是转染24h，如果转染48h则需要汇合率为50-70%），细胞的铺板和转染也可同时进行。

2）细胞转染

（1）吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。更换无血清培养基，每孔加入1mL。

（2）准备转染制备液，用灭菌后的EP管制备。以六孔板为例，A液：用200μl 无血清培养基稀释4μg质粒；B液:用200μl 无血清培养基稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。

（3）将配好的转染试剂逐滴加入到每个孔的培养基中，按十字方向轻摇混匀。

（4）6-12h后，将转染液吸出，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时。

（5）进行下一步实验。

注：不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率。

表3 不同规格的培养板需要加DNA和lipo2000的量

2. 慢病毒转染

原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。腺病毒、逆转录病毒和慢病毒载体已广泛用于哺乳动物细胞体内外的基因转染。

实验步骤：通过基因克隆方法获得重组病毒表达载体→转染包装细胞系，扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞（含有病毒特异性的受体）→从培养基中移除病毒→检测基因表达或沉默情况。

1）慢病毒转染贴壁细胞实验方法：

（1）慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。

（2）第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。

（3）(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。

（4）继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。

（5）继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。

2）慢病毒转染悬浮细胞实验方法：

（1）在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。

（2）(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。

（3）继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。

3. 电穿孔法

原理：利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔，同时细胞膜上电势升高，驱使带电荷的分子（如 DNA）以类似于电泳的方式经临时穿过孔进入细胞。

特点：与其他转染方法相比，电转染具有诸多优势，其中主要优势包括：适用于所有细胞类型的瞬时和稳定转染；在确定最佳电转染条件的情况下，能够在短时间内转染大量细胞。电转的主要缺点在于高电压脉冲可引起大量细胞死亡，仅部分细胞膜可以成功修复，因此相比化学转染方法，电转染需要使用更多数量的细胞。

实验步骤：利用电转缓冲液重悬细胞→对含有核酸，缓冲液，细胞的混合物给予合适的电脉冲→电脉冲在细胞膜上形成电势差，诱导产生暂时的孔使核酸进入细胞→将细胞返回到生长培养基中，使其慢慢恢复→检测基因表达或沉默情况。四、转染效率验证

设置阴性和阳性对照：一般在转染后24-48h，靶基因即在细胞内表达。可依据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测等实验。

■ 最有效的验证方式必须是qPCR验证，精确定量目的基因。

■ WB检测敲减或者过表达蛋白。

■ 使用荧光显微镜或流式细胞仪可以测定转染细胞和 GFP 蛋白表达细胞的百分比。利用含 GFP 或 RFP 之类报告基因的质粒作为阳性对照（阳性对照可以放在一个单独的孔中，或是与目的质粒共转染），评估转染效率。

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