酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种基于抗原-抗体特异性结合反应的高灵敏度免疫检测技术，广泛用于蛋白质、抗体、抗原等生物分子的定量分析。
ELISA技术路线
1.样本制备
• 收集样本：可以是血清、血浆、组织培养上清液或其他体液样本。
• 样本稀释：根据样本中目标分子的浓度，进行适当稀释，以确保信号在检测范围内。
2.包被抗原或抗体
• 包被板：将抗原或抗体溶液加入96孔ELISA板，通常每孔100 µl，在4°C孵育过夜或室温孵育1-2小时。包被的抗原或抗体与板表面结合形成固相。
• 洗涤：用洗涤液（如PBS + 0.05% Tween-20）洗涤ELISA板3-5次，以去除未结合的抗原或抗体。
3.封闭
• 封闭步骤：加入封闭液（如5% BSA或脱脂奶粉），在室温孵育1-2小时以封闭未被包被物质占据的板表面，防止非特异性结合。
• 洗涤：再次用洗涤液洗涤板3-5次。
4.加样和孵育
• 加入样本：将稀释后的样本或标准品加入板中，每孔通常100 µl，在37°C或室温下孵育1-2小时，使样本中的抗原与板上的抗体结合，或反之。
• 洗涤：用洗涤液洗涤板3-5次，去除未结合的样本成分。
5.加入检测抗体
• 加酶标记抗体：加入与抗原或抗体特异结合的酶标记二抗（如HRP标记的抗体），每孔100 µl，孵育1小时。
• 洗涤：用洗涤液洗涤板5次，去除未结合的酶标记抗体。
6.显色反应
• 加入底物溶液：加入酶反应底物（如TMB），每孔100 µl，孵育10-30分钟，直到颜色变化达到预期强度。
• 终止反应：加入终止液（如2M H2SO4），每孔50 µl，以稳定显色反应，防止过度反应。
7.数据检测
• 光密度测定：使用酶标仪在特定波长（如450 nm）读取每孔的光吸收值（OD值）。
• 标准曲线：通过标准品OD值建立标准曲线，根据样本的OD值定量目标分子的浓度。
8.数据分析
• 结果计算：根据标准曲线计算样本中目标分子的浓度。
• 数据统计：分析不同实验组和对照组之间的差异。
ELISA技术优点
1.高灵敏度：ELISA能够检测非常低浓度的抗原或抗体，通常可以达到pg/mL的检测范围。
2.高特异性：通过特异性抗体和抗原的结合，ELISA能够准确检测目标分子，非特异性干扰少。
3.定量能力：可精确测量生物分子的浓度，通过标准曲线进行定量分析。
4.高通量：ELISA能够在一个96孔或384孔板上同时检测多个样本，非常适合大规模筛选和临床检测。
5.操作简便：ELISA实验流程简单，易于标准化和自动化，便于临床和实验室广泛应用。
6.多样化：ELISA有多种类型（如直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA），可根据需求灵活选择。
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