实时定量PCR(qPCR),是一种用于检测和定量特定基因表达的分子生物学技术。通过使用荧光染料或特异性荧光探针,在PCR扩增过程中实时监测产物的积累,从而定量分析目标基因的表达水平。
实时检测图
原理图
以下是qPCR的技术路线及其优点:
qPCR技术路线
1.样本准备
• 提取RNA:从组织样本或培养细胞中提取总RNA。常用的方法包括Trizol法或商业RNA提取试剂盒。
• RNA纯化和质量检测:通过紫外分光光度计(如NanoDrop)测定RNA浓度和纯度(A260/A280比值应在1.8-2.0之间),使用琼脂糖凝胶电泳或Bioanalyzer检测RNA完整性。
2.cDNA合成
• 逆转录反应:使用逆转录酶和随机引物或Oligo(dT)引物,将总RNA逆转录成cDNA。反应体系中通常包括RNA模板、逆转录酶、dNTPs、缓冲液和引物。
• 逆转录条件:通常在37-55°C反应30-60分钟,随后在70-75°C下加热5分钟以终止反应。
3.qPCR反应体系准备
• 反应组分:包括cDNA模板、特异性引物对(前向引物和反向引物)、荧光染料(如SYBR Green)或特异性探针、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
• 引物设计:引物应特异性结合目标基因的序列,并尽量避免形成二聚体或发夹结构。引物长度通常为18-22个碱基,退火温度一般在55-65°C。
4.qPCR反应
• 加样:将上述反应组分混合后加入qPCR反应板的孔中(通常为96孔或384孔板),每孔反应体积通常为10-20 µl。
• 热循环条件:
初始变性:95°C,2-5分钟。
循环变性:95°C,10-15秒。
退火/延伸:55-60°C,30-60秒。
重复40个循环。
• 荧光信号检测:在每个循环的退火/延伸步骤末端检测荧光信号,记录Ct值(循环阈值)。
5.数据分析
• 标准曲线法:使用标准样本建立标准曲线,根据未知样本的Ct值定量目标基因的表达水平。
• ΔΔCt法:以参考基因(如GAPDH或β-actin)为内参,通过计算ΔCt和ΔΔCt值,分析目标基因的相对表达变化。
• 数据展示:通过柱状图、折线图等方式展示结果,比较实验组和对照组间的基因表达差异。
qPCR技术优点
1.高灵敏度:qPCR能够检测极低量的核酸样本,通常可以检测到少至10个拷贝的目标序列。
2.高特异性:通过特异性引物和探针,qPCR能够精确区分目标序列和非目标序列。
3.定量能力:qPCR可以实时监测PCR扩增产物的积累,精确测定基因表达水平,并且允许绝对定量和相对定量分析。
4.快速高效:qPCR反应通常在1-2小时内完成,较传统PCR更为快捷。
5.低污染风险:由于qPCR封闭体系和荧光检测方法,减少了样品处理过程中的污染风险。
6.适用范围广:qPCR适用于基因表达分析、基因突变检测、拷贝数变异分析、微生物定量检测等多个领域。
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