蛋白质免疫印迹技术（Western Blot，WB）是一种用于检测特定蛋白质的存在和表达量的常规实验技术。它结合了电泳分离、膜转移、抗体检测等步骤，能够定性和定量分析目标蛋白。
WB技术路线
1.样本制备
• 细胞裂解：从组织或细胞中提取蛋白质，使用裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）裂解细胞，并在4°C下震荡30分钟以完全裂解。裂解液中通常包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解和去磷酸化。
• 离心去除碎片：在4°C下12000-14000g离心10-15分钟，收集上清液（蛋白提取液）。
• 测定蛋白浓度：使用BCA法或Bradford法测定蛋白浓度，确保每个样本的蛋白浓度一致。
2.蛋白质电泳
• SDS-PAGE制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶（通常为8-12%），根据蛋白分子量选择合适的凝胶浓度。
• 加样和电泳：将蛋白样本与上样缓冲液混合，加热95°C，5分钟以变性蛋白。将样本上样至凝胶的样品孔中，以90-120 V电压进行电泳，分离蛋白质。
3.转膜
• 转移蛋白：使用半干转或湿转法将蛋白从凝胶转移至PVDF膜或硝酸纤维素膜上，通常在4°C下，100 V电压转移1-2小时。
• 膜封闭：用5%脱脂奶粉或BSA溶液在室温下封闭膜1小时，以阻止非特异性抗体结合。
4.抗体孵育
• 一抗孵育：用特异性的一抗（通常以1:1000-1:5000稀释）在4°C下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间取决于抗体和目标蛋白的特性。
• 洗膜：用TBST（TBS + 0.1% Tween-20）洗膜3次，每次5-10分钟，去除未结合的一抗。
• 二抗孵育：用HRP标记的二抗（通常以1:5000-1:10000稀释）在室温下孵育1小时。
• 洗膜：再次用TBST洗膜3次，每次5-10分钟，去除未结合的二抗。
5.信号检测
• 化学发光检测：在膜上加入ECL发光底物，通过酶促化学发光反应检测蛋白信号。
• 曝光和成像：使用X光胶片或化学发光成像系统记录发光信号，观察特定蛋白带。
6.数据分析
• 条带分析：使用图像分析软件（如ImageJ）分析蛋白条带的强度，对目标蛋白与内参蛋白（如β-actin或GAPDH）的比值进行定量。
• 数据统计：根据实验重复和统计学分析结果，对实验组与对照组之间的蛋白表达差异进行分析。
WB技术优点
1.高特异性：通过使用特异性抗体，WB能够精确检测特定蛋白，即使在复杂的样本背景中也能识别目标蛋白。
2.定性与定量分析：WB不仅能够确认蛋白的存在，还可以定量分析蛋白表达水平的变化。
3.多样性：WB适用于检测各种类型的蛋白，包括细胞膜蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白等。
4.敏感性：化学发光法等灵敏检测技术的应用，使WB能够检测低丰度的蛋白质。
5.分子量确认：电泳分离步骤允许根据分子量判断蛋白质的大小，帮助区分目标蛋白及其可能的不同剪接或修饰形式。
6.多重检测：同一膜上可以进行多重蛋白检测，通过剥膜技术可以重复检测不同蛋白，为研究提供更全面
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