免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是通过抗体特异性结合组织切片中的抗原来检测蛋白表达和分布的技术。广泛应用于基础研究、临床诊断和病理分析。
免疫组化技术路线
1.样本准备
• 固定和切片：使用4%多聚甲醛固定组织，进行石蜡包埋和切片（3-5 μm）。
• 脱蜡和再水化：将石蜡切片脱蜡，经过梯度乙醇再水化至水。
2.抗原修复
• 热修复：使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 8.0）在微波炉或高压锅中进行热修复，破坏交联结构，暴露抗原位点。
• 酶修复：对于某些抗原，使用蛋白酶K或胰蛋白酶消化以暴露抗原。
3.封闭
• 封闭非特异性结合位点：使用5%-10%山羊血清或牛血清白蛋白（BSA）封闭切片，防止非特异性抗体结合。
4.抗体孵育
• 一抗孵育：将切片与特异性的一抗孵育1-2小时（室温）或过夜（4°C）。
• 洗涤：使用PBS或TBS洗涤去除未结合的一抗。
5.二抗孵育
• 二抗孵育：用HRP标记的二抗或荧光标记二抗孵育30-60分钟。
• 洗涤：再次用PBS或TBS洗涤。
6.信号检测和显色
• DAB显色：使用DAB显色剂，孵育数分钟直至出现棕色信号。
• 对比染色：使用苏木素进行细胞核染色。
7.封片和观察
• 脱水和封片：切片通过梯度乙醇脱水，二甲苯透明化，并封片。
• 显微镜观察：在光学显微镜下观察和拍照记录。
免疫组化技术优点
1.定位准确：能够直接在组织切片中定位和定量蛋白表达，提供组织特异性表达信息。
2.应用广泛：适用于各种类型的组织和细胞，广泛用于基础研究和临床病理诊断。
3.高灵敏度：通过信号放大技术，如使用酶标二抗，显著提高检测灵敏度。
4.结果直观：染色结果直观，易于通过显微镜直接观察并记录。
5.多重染色：可以在同一组织切片上检测多种蛋白，通过不同的标记和染色方法实现多重分析。
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