免疫荧光(Immunofluorescence, IF)是通过荧光标记的抗体检测组织或细胞中目标蛋白分布和表达的技术。常用于研究蛋白定位、细胞信号通路和组织结构。
免疫荧光技术路线
1.样本准备
• 固定和切片:组织样本用4%多聚甲醛固定,进行冰冻切片(5-10 μm)或细胞培养固定。
• 透化(如需):使用0.1%-0.5% Triton X-100透化细胞膜,暴露细胞内抗原。
2.封闭
• 封闭非特异性结合:用5%-10% BSA或山羊血清封闭切片或细胞,以减少背景染色。
3.抗体孵育
• 一抗孵育:将样本与特异性一抗孵育1-2小时(室温)或过夜(4°C)。
• 洗涤:用PBS洗涤,去除未结合的一抗。
4.二抗孵育
• 荧光二抗孵育:使用荧光标记的二抗(如FITC、Alexa Fluor系列),孵育30-60分钟。
• 洗涤:再次用PBS洗涤。
5.核染(可选)
• DAPI染色:若需核染,使用DAPI或Hoechst 33342染色细胞核。
6.封片和观察
• 封片:用抗荧光淬灭封片剂封片,以减少荧光信号衰减。
• 显微镜观察:使用荧光显微镜观察和拍照,分析荧光信号。
免疫荧光技术优点
1.高特异性和灵敏度:使用荧光标记的抗体,可以实现特异性高、背景低的蛋白检测。
2.多重标记能力:可以同时检测多种蛋白,通过不同荧光染料区分。
3.空间分辨率高:能够在单细胞或亚细胞水平上观察蛋白定位和分布。
4.实时观察:适用于活细胞或组织的动态观察,分析蛋白在细胞过程中的变化。
5.定量分析:通过荧光强度的测量,可以进行半定量或定量分析。
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