流式细胞术是一种在液流系统中,快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质,并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开,以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
流式细胞术
细胞凋亡
细胞周期
检测内容
• 细胞表面分子的检测与分析;
• 细胞内或细胞核内抗原检测与分析,如胞内细胞因子、调节性T细胞(Treg,CD4+CD25+Foxp3+);
• 细胞凋亡的检测与分析——如PI单染法、Annexin-V-PI复染法、末端转移酶标记技术(TUNEL)、细胞周期特异性细胞凋亡的检测(PI-Annexin-V,PA法);
• DNA含量检测与细胞周期的分析——如药物对细胞周期的影响、流式细胞核型分析;
• 细胞增殖的检测与分析;
流程
1.实验设计
• 明确实验目的:例如,检测特定细胞表面标志物、细胞内信号分子、细胞周期分布、凋亡细胞等。
• 选择合适的荧光抗体:根据实验目的选择标记特定抗原的抗体。确保抗体的荧光染料不会在流式细胞仪的检测通道上有重叠,以避免荧光补偿问题。
• 设置实验组和对照组:包括阳性对照、阴性对照(如同型对照)、单染色对照、荧光补偿对照等。
2. 细胞准备
• 样本收集:从外周血、组织、培养细胞等获得细胞样本。使用适当的消化酶(如胰蛋白酶、胶原酶)处理组织以获取单细胞悬液。
• 细胞洗涤:将细胞离心(通常为300-400g,5分钟),用PBS或细胞培养基洗涤,去除残留的血清和其他杂质。
• 细胞计数:使用细胞计数器或台盼蓝染色计数细胞,以确定细胞浓度。通常,流式细胞分析每个样本需要10^5-10^6个细胞。
• 裂解红细胞(如血液样本):使用红细胞裂解缓冲液处理样本以去除红细胞,随后离心并用PBS重悬细胞。
3. 细胞染色
• 染色抗体准备:按照推荐浓度稀释标记有荧光染料的抗体(如1:100,具体取决于抗体浓度和细胞数量)。
• 抗体孵育:将细胞悬液与抗体混合,通常在暗处、4°C条件下孵育30分钟至1小时,以避免荧光淬灭。
• 洗涤细胞:孵育后,用PBS洗涤细胞1-2次以去除未结合的抗体。每次离心后弃上清,并用新鲜PBS重悬细胞。
• 细胞固定(可选):对于需要检测细胞内标志物的实验,可用4%多聚甲醛固定细胞10-15分钟,随后用PBS洗涤。
4. 流式细胞仪检测
• 过滤细胞悬液:使用40 µm的细胞过滤器过滤细胞悬液,以避免大颗粒或细胞团阻塞流式细胞仪。
• 校准流式细胞仪:使用校准微珠和单染色对照样本校准流式细胞仪,设置合适的电压和增益,调整荧光通道的补偿值。
• 样本上机检测:将样本逐个进样,流速通常设置在中低速(如12-30 µl/min),以确保准确的细胞计数和数据质量。
• 实时监测:通过流式细胞仪软件监控检测数据,确保细胞群的门控正确和信号强度稳定。
5. 数据采集与分析
• 数据保存:采集的数据文件通常以FCS(Flow Cytometry Standard)格式保存。
• 数据分析:使用流式细胞数据分析软件(如FlowJo、FCS Express)对采集的数据进行分析。
• 设置门控:通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)设置门控,以区分细胞群体和去除碎片、杂质。
• 荧光通道分析:分析各个荧光通道中的信号强度,以确定不同标志物的表达情况。
• 计算结果:通过直方图或散点图分析,计算阳性细胞的百分比、荧光强度的中位数等数据。
• 补偿:如果使用多种荧光染料,需要进行荧光补偿,校正不同荧光通道之间的光谱重叠。
6. 数据统计与结果展示
• 数据统计:使用统计软件分析多个实验样本之间的差异,如t检验、ANOVA等,以确定实验组与对照组之间的显著性差异。
• 结果展示:通过直方图、散点图或条形图等形式展示结果,便于清晰地说明细胞亚群的分布和各标志物的表达水平。
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