细胞凋亡(apoptosis)即程序性细胞死亡(programmedcel death,PCD)。它是一种不同于坏死的由基因调控的细胞主动性死亡过程,是细胞在一定的生理或病理状态下,遵循程序,脱落离体或裂解为若干凋亡小体,而被其他细胞吞噬。细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维持正常组织和器官的细胞数目恒定与生长平衡、乃至机体衰老方面都起着重要的作用。
细胞凋亡与细胞坏死不同。细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡是一个主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用;它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
目前,常用的细胞凋亡检测方法如下:
一、光学显微镜和倒置显微镜
1、未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
2、染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
二、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有:Hoechst 33342, Hoechst 33258,DAPI。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料。DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区,紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状或折缝样,部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
三、流式磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法)检测法
Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
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