流式细胞术
流式细胞术是一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
流式细胞术
细胞凋亡
细胞周期
检测内容
• 细胞表面分子的检测与分析；
• 细胞内或细胞核内抗原检测与分析,如胞内细胞因子、调节性T细胞（Treg，CD4+CD25+Foxp3+）；
• 细胞凋亡的检测与分析——如PI单染法、Annexin-V-PI复染法、末端转移酶标记技术（TUNEL）、细胞周期特异性细胞凋亡的检测（PI-Annexin-V，PA法）；
• DNA含量检测与细胞周期的分析——如药物对细胞周期的影响、流式细胞核型分析；
• 细胞增殖的检测与分析；
流程
1.实验设计
• 明确实验目的：例如，检测特定细胞表面标志物、细胞内信号分子、细胞周期分布、凋亡细胞等。
• 选择合适的荧光抗体：根据实验目的选择标记特定抗原的抗体。确保抗体的荧光染料不会在流式细胞仪的检测通道上有重叠，以避免荧光补偿问题。
• 设置实验组和对照组：包括阳性对照、阴性对照（如同型对照）、单染色对照、荧光补偿对照等。
2. 细胞准备
• 样本收集：从外周血、组织、培养细胞等获得细胞样本。使用适当的消化酶（如胰蛋白酶、胶原酶）处理组织以获取单细胞悬液。
• 细胞洗涤：将细胞离心（通常为300-400g，5分钟），用PBS或细胞培养基洗涤，去除残留的血清和其他杂质。
• 细胞计数：使用细胞计数器或台盼蓝染色计数细胞，以确定细胞浓度。通常，流式细胞分析每个样本需要10^5-10^6个细胞。
• 裂解红细胞（如血液样本）：使用红细胞裂解缓冲液处理样本以去除红细胞，随后离心并用PBS重悬细胞。
3. 细胞染色
• 染色抗体准备：按照推荐浓度稀释标记有荧光染料的抗体（如1:100，具体取决于抗体浓度和细胞数量）。
• 抗体孵育：将细胞悬液与抗体混合，通常在暗处、4°C条件下孵育30分钟至1小时，以避免荧光淬灭。
• 洗涤细胞：孵育后，用PBS洗涤细胞1-2次以去除未结合的抗体。每次离心后弃上清，并用新鲜PBS重悬细胞。
• 细胞固定（可选）：对于需要检测细胞内标志物的实验，可用4%多聚甲醛固定细胞10-15分钟，随后用PBS洗涤。
4. 流式细胞仪检测
• 过滤细胞悬液：使用40 µm的细胞过滤器过滤细胞悬液，以避免大颗粒或细胞团阻塞流式细胞仪。
• 校准流式细胞仪：使用校准微珠和单染色对照样本校准流式细胞仪，设置合适的电压和增益，调整荧光通道的补偿值。
• 样本上机检测：将样本逐个进样，流速通常设置在中低速（如12-30 µl/min），以确保准确的细胞计数和数据质量。
• 实时监测：通过流式细胞仪软件监控检测数据，确保细胞群的门控正确和信号强度稳定。
5. 数据采集与分析
• 数据保存：采集的数据文件通常以FCS（Flow Cytometry Standard）格式保存。
• 数据分析：使用流式细胞数据分析软件（如FlowJo、FCS Express）对采集的数据进行分析。
• 设置门控：通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设置门控，以区分细胞群体和去除碎片、杂质。
• 荧光通道分析：分析各个荧光通道中的信号强度，以确定不同标志物的表达情况。
• 计算结果：通过直方图或散点图分析，计算阳性细胞的百分比、荧光强度的中位数等数据。
• 补偿：如果使用多种荧光染料，需要进行荧光补偿，校正不同荧光通道之间的光谱重叠。
6. 数据统计与结果展示
• 数据统计：使用统计软件分析多个实验样本之间的差异，如t检验、ANOVA等，以确定实验组与对照组之间的显著性差异。
• 结果展示：通过直方图、散点图或条形图等形式展示结果，便于清晰地说明细胞亚群的分布和各标志物的表达水平。
平板克隆形成
平板克隆形成实验是一种用于评估单个细胞的增殖和集落形成能力的常用方法。该实验广泛用于研究细胞的转化能力、增殖潜力、药物敏感性等。
以下是平板克隆形成技术的基本流程：
1. 实验设计
• 明确实验目的，如评估细胞增殖能力、药物或基因操作对细胞增殖的影响。
• 选择合适的细胞系（如癌细胞系或正常细胞系）。
• 确定实验组和对照组，例如药物处理组、基因过表达/沉默组和未处理的对照组。
2. 细胞准备
• 细胞培养：将实验所需的细胞培养至对数生长期，确保细胞状态健康。
• 细胞计数：使用细胞计数仪或台盼蓝染色法计数细胞，确保细胞数量足够且活性良好。
3. 细胞接种
• 在6孔板、12孔板或更大的培养皿中接种细胞。通常，每个孔或培养皿接种200-1000个细胞，具体数量取决于细胞类型和实验设计。
• 轻轻摇动培养板以均匀分布细胞，使其单独分散在培养基中。
4. 培养与加药处理
• 将接种后的细胞培养板放入培养箱中（通常设定在37°C，5% CO2）孵育1-2周，具体时间视细胞增殖速度而定。
• 如需检测药物或其他处理对克隆形成的影响，在接种细胞后24小时内加入相应的药物或处理物质，并维持一定的浓度。
• 定期更换培养基（如每2-3天一次），以提供足够的营养和保持环境的稳定。
5. 克隆形成观察
• 在显微镜下定期观察细胞生长情况，监测克隆（细胞集落）的形成情况。克隆通常是由50个以上的细胞组成的明显集落。
• 记录克隆的大小和数量，确保对比不同实验组间的差异。
6. 固定和染色
• 当克隆达到适当大小时（通常为1-2周后），弃去培养基，用PBS轻轻洗涤细胞两次。
• 加入4%多聚甲醛溶液固定细胞，室温下固定10-15分钟。
• 轻轻洗涤固定液后，加入染色液（如0.1%结晶紫染色液），室温下染色10-30分钟，直到克隆清晰可见。
• 用自来水轻轻冲洗去除多余的染色液，晾干培养皿。
7. 克隆计数与分析
• 在显微镜下观察并计数每个孔或培养皿中形成的克隆数量。
• 记录数据，计算克隆形成率（克隆形成率 = （形成的克隆数量 / 接种的细胞总数）× 100%）。
• 根据实验组和对照组的克隆形成率比较不同处理的影响。
细胞成球实验
细胞成球实验（Spheroid Formation Assay）是一种三维细胞培养技术，用于研究细胞的增殖、分化和肿瘤球形成能力。该实验模拟体内肿瘤微环境，特别适用于癌症研究和干细胞研究。
1. 实验设计
• 明确实验目的，例如研究肿瘤球形成能力、评估药物对肿瘤干细胞的影响或筛选基因操作对细胞成球能力的影响。
• 选择合适的细胞系，如癌症细胞、干细胞或肿瘤干细胞。
2. 细胞培养
• 将细胞在标准的培养条件下培养至对数生长期（通常使用含10%胎牛血清的完全培养基）。
• 用PBS洗涤细胞两次，去除浮游细胞和杂质。
• 使用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，收集细胞悬液。
• 通过离心（通常为1000 rpm，5分钟）收集细胞，并用PBS或培养基重悬。
• 计数细胞浓度并调整至合适密度（如每毫升1×10^3至1×10^4个细胞）。
3. 接种细胞
• 低粘附性培养板：使用低粘附性96孔板，每孔接种100-200 µl的细胞悬液。每孔的细胞数通常为100-1000个。
• 悬滴培养法（可选）：在培养皿盖子上点滴悬滴（通常为20-50 µl，包含500-1000个细胞），将培养皿倒置在含有无菌水的培养皿中，以保持湿度。
• 确保细胞在孔内均匀分布，避免堆积。
4. 细胞成球培养
• 将接种好的培养板置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育。
• 使用无血清培养基或低血清培养基，添加特定的生长因子（如EGF，FGF）以促进球体形成。
• 孵育时间通常为3-7天，视细胞类型和实验设计而定。
• 定期检查培养情况，如果培养基蒸发可轻轻补充培养基，避免直接滴加到细胞球上。
5. 显微镜观察
• 使用倒置显微镜在不同时间点（如1天、3天、7天）观察细胞球的形成。
• 记录细胞球的形态、大小和数量，拍摄图像以便后续分析。
• 注意：成球的效率和球体的形态可能因细胞类型和培养条件而异。
6. 数据分析
• 球体数量和大小测量：使用显微镜和图像分析软件（如ImageJ）计算每个孔中形成的球体数量和直径。
• 形态分析：评估球体的形态，注意球体的均匀性、致密性和边缘清晰度。
• 统计学分析：将实验组与对照组进行比较，分析药物、基因操作或其他处理对细胞成球能力的影响。使用统计学方法（如t检验、ANOVA）确定结果的显著性。
细胞凋亡（TUNEL）
TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）技术是一种检测细胞凋亡的方法。该技术基于终端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP掺入断裂的DNA链3'末端来检测DNA片段化，是检测细胞凋亡的经典方法之一。
以下是TUNEL检测的基本流程：
1. 实验设计
• 明确实验目的，如检测特定处理（如药物、基因操作、放射处理）对细胞凋亡的影响。
• 选择合适的细胞系（如癌细胞、神经元、成纤维细胞等）或组织样本。
• 确定实验组和对照组，例如药物处理组、阳性对照组（已知诱导凋亡的处理）和阴性对照组（不处理或只加溶剂）。
2. 细胞/组织准备
• 细胞培养：将细胞培养至对数生长期，确保细胞状态健康。根据实验需求，将细胞种植于合适的培养皿或多孔板（如24孔板、6孔板等）中。
• 组织样本：对于组织切片样本，使用福尔马林固定组织并通过石蜡包埋，切片厚度一般为4-6微米。
3. 处理和诱导凋亡
• 按实验设计，加入诱导凋亡的药物或其他处理方式（如紫外照射、放射处理、化学药物）。
• 设定合适的处理时间，根据具体药物或处理方式可能需要数小时到数天。
• 对照组设置阳性和阴性对照，阳性对照可以使用已知的凋亡诱导剂（如staurosporine）。
4. 固定和穿透
• 处理结束后，去除培养基，使用PBS（磷酸盐缓冲液）轻轻洗涤细胞或组织切片两次。
• 细胞固定：加入4%多聚甲醛（PFA）溶液，室温下固定细胞10-30分钟。
• 组织切片固定：若使用冰冻切片或石蜡切片，切片制备好后可直接用于固定。
• 固定后，使用PBS洗涤两次。
• 穿透处理：加入0.1% Triton X-100和0.1%柠檬酸钠混合液，室温下处理5-10分钟，以增加膜的通透性。
5. TUNEL染色
• 准备TUNEL反应混合物：按照试剂盒说明书，将TdT酶与标记的dUTP（通常是FITC-dUTP或BrdU-dUTP）按比例混合。
• 去除PBS，加入TUNEL反应混合物，覆盖细胞或组织切片。
• 在37°C孵育30-60分钟，避免光照（使用避光的湿盒进行孵育）。
• 孵育结束后，PBS洗涤3次，每次5分钟。
6. 染色和封片
• 对细胞/切片进行DAPI染色（或其他细胞核染色剂），以便区分细胞核并检测总的细胞数。
• 加入适量的DAPI染色液，室温避光孵育5-10分钟。
• 用PBS洗涤两次。
• 在组织切片上滴加抗荧光淬灭封片液后，盖上盖玻片，封片并固化。
7. 显微镜观察
• 使用荧光显微镜观察标记细胞。TUNEL阳性细胞显示绿色荧光（FITC），细胞核染色显示蓝色（DAPI）。
• 拍摄显微照片，并记录每个视野下的TUNEL阳性细胞数和总的细胞数。
细胞划痕
细胞划痕实验（Scratch Assay），也称为伤口愈合实验，是一种常用的体外方法，用于研究细胞迁移能力。该实验通过在细胞单层中制造“划痕”或“伤口”，然后观察细胞在划痕区域的移动速度和覆盖能力，评估细胞迁移行为。
以下是细胞划痕实验的基本技术流程：
1. 实验设计
• 确定实验目的，例如研究基因操作或药物处理对细胞迁移能力的影响。
• 选择合适的细胞系，这些细胞应具有良好的黏附性和迁移能力。
• 设置不同的实验组和对照组，包括处理组（如药物、基因操作）和阴性对照组。
2. 细胞培养
• 将细胞培养在合适的培养皿或6孔板中，培养基通常为含10%胎牛血清的完全培养基。
• 让细胞生长至90-100%汇合，形成一个均匀的细胞单层。
• 细胞汇合后，用PBS轻轻洗涤两次，去除细胞碎屑和浮游细胞。
3. 制造划痕
• 使用无菌移液枪头、细胞刮刀或无菌尖头在细胞单层上垂直划一道直线，形成一个“划痕”或“伤口”区域。
• 每个孔中可以做一条或多条平行划痕，确保不同处理组的划痕宽度和数量一致。
• 用PBS轻轻洗涤两次，去除划痕时产生的细胞碎片，避免影响后续观察。
4. 处理和孵育
• 根据实验设计，将含药物或无血清的培养基加入细胞培养皿或6孔板中。
• 将培养板放入37°C、5% CO2的培养箱中孵育。通常不加血清或使用低血清培养基，以减少细胞增殖的影响。
• 在不同时间点（如0小时、6小时、12小时、24小时等）观察划痕区域的细胞迁移情况。
5. 显微镜观察和图像拍摄
• 在显微镜下使用低倍物镜观察划痕区域的细胞迁移。
• 使用数字相机拍摄每个时间点的划痕图像，确保相同的划痕位置和焦距。
• 对于定量分析，建议使用图像分析软件（如ImageJ）测量划痕面积或宽度的变化。
6. 数据分析
• 分析划痕闭合的速度或迁移的细胞数量。可测量划痕的宽度或面积的减少，来评估细胞的迁移速度。
• 计算迁移速率（划痕宽度或面积减少的速度）。
• 比较不同实验组与对照组之间的差异，评估处理对细胞迁移能力的影响。
• 使用统计学方法（如t检验、ANOVA）分析实验结果的显著性。
细胞加药处理
细胞加药处理是细胞生物学实验中常见的操作，用于研究药物对细胞的影响，包括细胞增殖、凋亡、信号通路激活等。
以下是细胞加药处理的基本流程：
1. 实验设计与药物选择
• 根据研究目的选择合适的药物或化合物。
• 确定药物浓度范围和处理时间。通常可以进行剂量梯度实验（如1 µM, 10 µM, 50 µM等）以找到最有效的浓度。
2. 药物制备
• 选择合适的溶剂（如DMSO、乙醇、水等）溶解药物，并准备高浓度的储备液。
• 通过无菌过滤器过滤药物溶液，以确保无菌。
• 储备液通常会储存在-20°C或-80°C，并在使用前稀释至工作浓度。
3. 细胞培养与准备
• 将实验所需的细胞种植在合适的培养容器中（如96孔板、6孔板或培养瓶），并使其生长至所需的密度（如70-80%汇合）。
• 在加药前24小时更换培养基，以确保细胞处于良好的生长状态。
4. 加药处理
• 根据实验设计，稀释药物至所需的工作浓度。通常将药物直接加入到含有细胞的培养基中。
• 设置对照组：包括未加药的空白对照组和加有药物溶剂（如DMSO）的溶剂对照组，以排除溶剂对细胞的影响。
• 轻轻摇动培养板或培养瓶以均匀分布药物。
5. 孵育处理
• 将加药后的细胞放入培养箱（通常设定在37°C，5% CO2）中孵育。
• 孵育时间根据实验要求而定，可从几小时到几天不等。常见的时间点包括6小时、12小时、24小时、48小时等。
细胞迁移
Transwell小室实验是一种常用于评估细胞迁移能力的体外实验方法。该方法利用带有孔径的Transwell小室（通常是聚碳酸酯膜），通过测量细胞从上室迁移到下室的能力来研究细胞在特定条件下的运动行为。
以下是细胞迁移实验的基本技术流程：
1. 实验设计
• 明确实验目的，例如评估某种药物、基因敲低/过表达或其他条件对细胞迁移和侵袭能力的影响。
• 选择合适的细胞系（如肿瘤细胞、成纤维细胞等）。
• 设置不同的实验组和对照组，包括处理组（如药物、基因操作）和阴性对照组。
2. Transwell小室准备
• 直接使用Transwell小室进行。
3. 细胞准备
• 将细胞培养至对数生长期，确保细胞状态健康。
• 用PBS洗涤细胞两次，消化细胞（如使用胰蛋白酶-EDTA溶液），然后离心收集。
• 使用无血清培养基重悬细胞，并调整细胞密度（通常为1×10^5至5×10^5个细胞/ml）。
4. 细胞接种
• 上室接种：将准备好的细胞悬液（通常为100-200 μl）加入Transwell小室的上室中。
• 下室添加吸引剂：向Transwell小室的下室中加入含有吸引剂的培养基（如含10%胎牛血清的完全培养基），以诱导细胞迁移或侵袭。
• 注意轻轻加入以避免破坏上室基质胶或干扰细胞分布。
5. 孵育
• 将Transwell小室放入37°C、5% CO2的培养箱中孵育24-48小时，具体时间视细胞类型和实验目的而定。
• 在此期间，细胞在吸引剂的引导下从上室迁移或侵袭通过多孔膜进入下室。
6. 细胞固定和染色
• 孵育结束后，弃去上室中的培养基，用PBS轻轻洗涤细胞两次。
• 用棉签轻轻擦拭上室的膜表面以去除未迁移或未侵袭的细胞。
• 用4%多聚甲醛溶液固定穿透到膜下表面的细胞，室温下固定10-15分钟。
• 固定后，用PBS洗涤细胞两次。
• 加入0.1%结晶紫染液（或其他染色剂）染色15-30分钟，直到穿透的细胞被清晰染色。
• 用PBS洗涤两次去除多余染料。
7. 显微镜观察和计数
• 在倒置显微镜下观察染色后的细胞，并拍摄显微照片。
• 选择随机视野，计数每个视野中迁移或侵袭的细胞数量。
• 计算每个实验条件下的平均迁移或侵袭细胞数。
8. 数据分析
• 记录每组细胞的计数数据，计算平均迁移或侵袭细胞数。
• 比较实验组与对照组之间的差异，分析不同处理对细胞迁移或侵袭能力的影响。
• 使用统计学方法（如t检验、ANOVA）分析实验结果的显著性。
细胞侵袭（transwell）
Transwell小室实验是一种常用于评估细胞侵袭能力的体外实验方法。该方法利用带有孔径的Transwell小室（通常是聚碳酸酯膜），通过测量细胞从上室迁移到下室的能力来研究细胞在特定条件下的运动行为。
以下是细胞侵袭实验的基本技术流程：
1. 实验设计
• 明确实验目的，例如评估某种药物、基因敲低/过表达或其他条件对细胞迁移和侵袭能力的影响。
• 选择合适的细胞系（如肿瘤细胞、成纤维细胞等）。
• 设置不同的实验组和对照组，包括处理组（如药物、基因操作）和阴性对照组。
2. Transwell小室准备
• 在Transwell小室上室的膜表面均匀涂布基质胶（如Matrigel），模拟细胞外基质环境。涂布后将小室置于37°C培养箱中孵育30-60分钟，使胶固化。
3. 细胞准备
• 将细胞培养至对数生长期，确保细胞状态健康。
• 用PBS洗涤细胞两次，消化细胞（如使用胰蛋白酶-EDTA溶液），然后离心收集。
• 使用无血清培养基重悬细胞，并调整细胞密度（通常为1×10^5至5×10^5个细胞/ml）。
4. 细胞接种
• 上室接种：将准备好的细胞悬液（通常为100-200 μl）加入Transwell小室的上室中。
• 下室添加吸引剂：向Transwell小室的下室中加入含有吸引剂的培养基（如含10%胎牛血清的完全培养基），以诱导细胞迁移或侵袭。
• 注意轻轻加入以避免破坏上室基质胶或干扰细胞分布。
5. 孵育
• 将Transwell小室放入37°C、5% CO2的培养箱中孵育24-48小时，具体时间视细胞类型和实验目的而定。
• 在此期间，细胞在吸引剂的引导下从上室迁移或侵袭通过多孔膜进入下室。
6. 细胞固定和染色
• 孵育结束后，弃去上室中的培养基，用PBS轻轻洗涤细胞两次。
• 用棉签轻轻擦拭上室的膜表面以去除未迁移或未侵袭的细胞。
• 用4%多聚甲醛溶液固定穿透到膜下表面的细胞，室温下固定10-15分钟。
• 固定后，用PBS洗涤细胞两次。
• 加入0.1%结晶紫染液（或其他染色剂）染色15-30分钟，直到穿透的细胞被清晰染色。
• 用PBS洗涤两次去除多余染料。
7. 显微镜观察和计数
• 在倒置显微镜下观察染色后的细胞，并拍摄显微照片。
• 选择随机视野，计数每个视野中迁移或侵袭的细胞数量。
• 计算每个实验条件下的平均迁移或侵袭细胞数。
8. 数据分析
• 记录每组细胞的计数数据，计算平均迁移或侵袭细胞数。
• 比较实验组与对照组之间的差异，分析不同处理对细胞迁移或侵袭能力的影响。
• 使用统计学方法（如t检验、ANOVA）分析实验结果的显著性。
细胞增殖实验（CCK8_MTT_EDU_BRDU）
EDU
BRDU
CCK8
细胞增殖实验是一种用于研究细胞生长和分裂能力的实验技术，常用于检测药物、基因操作或其他外界因素对细胞增殖的影响。以下是细胞增殖实验的基本技术流程：
1. 实验设计
• 明确实验目的，例如检测某种药物、基因操作、环境条件对细胞增殖的影响。
• 选择适合的细胞系，如癌细胞系（HeLa、MCF-7等）或正常细胞系（如成纤维细胞）。
• 确定实验组和对照组，并设定加药浓度和处理时间。
2. 细胞准备
• 细胞培养：将细胞种植在适合的培养容器中（如96孔板、24孔板或6孔板），使其生长至约70-80%汇合，确保细胞状态健康。
• 细胞接种：按照实验设计的密度（如每孔2000-5000个细胞），将细胞均匀接种到孔板中，轻轻摇动以均匀分布细胞。
• 孵育：将细胞置于培养箱中孵育（通常37°C，5% CO2）24小时，以确保细胞贴壁和恢复。
3. 处理和加药
• 按实验设计，加入不同浓度的药物、转染试剂或其他处理物质。
• 设置对照组，如无处理的空白对照组、仅加入溶剂的对照组（如DMSO对照）。
• 轻轻摇动培养板以确保均匀混合。
• 在处理后将细胞继续放回培养箱中孵育，根据实验要求选择不同的时间点（如24小时、48小时、72小时）进行观察。
4. 细胞增殖检测方法
• MTT法（甲基噻唑基四氮唑）：MTT法是一种经典的检测细胞活性和增殖的方法，通过测定细胞代谢产生的还原型蓝色结晶来反映细胞数量。
• 向每个孔中加入适量的MTT溶液（通常为0.5 mg/ml），并在培养箱中孵育2-4小时。
• 孵育结束后，吸弃培养基并加入DMSO溶解形成的蓝色甲臢结晶。
• 在酶标仪上测定570 nm处的吸光度，吸光度值与细胞数量成正比。
• CCK-8法（细胞计数试剂盒-8）：CCK-8法是一种更灵敏且更方便的增殖检测方法，不需要溶解步骤。
• 加入CCK-8试剂到每个孔中（通常10 μl CCK-8溶液+100 μl培养基），轻轻混匀。
• 在培养箱中孵育1-4小时，根据培养基颜色变化决定终止时间。
• 使用酶标仪测定450 nm处的吸光度。
• EdU掺入法：EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）掺入法是一种检测DNA合成的增殖方法，通过EdU掺入新合成的DNA链。
• 加入EdU工作溶液到细胞培养基中，并在培养箱中孵育1-2小时。
• 使用Click-iT反应进行荧光标记检测EdU掺入量，荧光强度与细胞增殖速率成正比。
• BrdU掺入法：BrdU（溴脱氧尿苷）掺入法是另一种检测DNA合成的经典方法。
• 在细胞培养基中加入BrdU，孵育一定时间。
• 通过免疫荧光或ELISA法检测BrdU掺入量。
5. 数据收集与分析
• 记录每个实验组在不同时间点的吸光度或荧光值。
• 计算细胞增殖率，相对增殖率或细胞存活率。
• 使用统计学方法（如t检验、ANOVA）比较实验组与对照组之间的差异。
细胞转染（过表达沉默）
细胞转染是将外源性核酸（如DNA或RNA）引入细胞内，从而在体外操控基因表达的一项技术。它可以用来过表达特定基因或沉默目标基因。以下是细胞转染的基本流程，包括过表达和基因沉默两种情况：
一、过表达（基因过表达）技术流程
1.构建表达载体
• 选择合适的质粒载体（如pCMV、pEGFP），载体中包含目的基因的编码序列和启动子（如CMV启动子）以确保高效表达。
• 使用分子克隆技术将目标基因插入到载体的多克隆位点（MCS）中，并通过测序验证插入是否正确。
2.准备质粒DNA
• 从细菌培养物中提取质粒DNA，并使用高纯度的质粒提取试剂盒进行纯化。
• 测定质粒DNA的浓度和纯度（A260/A280比值），确保其适合转染使用。
3.细胞培养与准备
• 在无菌条件下，将细胞种植在6孔板或其他合适的培养容器中，使其生长至70-90%汇合。
• 在转染前约24小时更换培养基，以保证细胞处于良好的生长状态。
4.转染试剂的选择
• 根据细胞类型选择合适的转染试剂（如Lipofectamine 3000、PEI、Fugene HD等），这些试剂可以帮助质粒DNA进入细胞。
• 准备转染试剂和质粒DNA的混合物，根据转染试剂的使用说明书，调整DNA和试剂的比例，通常在室温下孵育5-20分钟。
5.转染
• 将转染试剂-DNA混合物滴加到细胞培养基中，轻轻摇匀。
• 将细胞培养板放入培养箱中继续培养（37°C，5% CO2），通常4-6小时后更换培养基以减少转染试剂的毒性。
6.检测转染效率
• 转染后24-48小时，通过荧光显微镜（如质粒带有GFP标记）或使用qPCR、Western blot等方法检测目标基因的表达水平，以评估转染效率。
二、基因沉默（RNA干扰，RNAi）技术流程
1.合成或设计siRNA/shRNA
• 根据目标基因的序列，设计特异性的小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）。
• 使用在线工具或软件（如BLOCK-iT RNAi Designer）来确保设计的RNA序列能够有效靶向目标基因并降低脱靶效应。
2.合成或构建RNA干扰载体
• 合成siRNA或将shRNA序列克隆到RNA干扰载体（如pLKO.1）中，确保质粒含有启动子（如U6启动子）以驱动shRNA表达。
• 对构建的shRNA质粒进行测序验证。
3.细胞培养与准备
• 将目标细胞系种植在6孔板或其他合适的培养容器中，使其达到50-70%汇合。
• 24小时后更换培养基，以保持细胞健康。
4.转染siRNA/shRNA
• 选择适当的转染试剂（如Lipofectamine RNAiMAX、PEI），按照试剂说明书准备siRNA或shRNA质粒与转染试剂的混合物。
• 将混合物滴加到细胞培养基中，轻轻摇匀。
• 在培养箱中继续培养细胞（37°C，5% CO2），并在4-6小时后更换培养基以减少毒性。
5.基因沉默效果检测
• 转染后48-72小时，通过qPCR检测目标基因mRNA的表达水平或通过Western blot检测蛋白表达水平。
• 使用负对照（如非靶向的siRNA）来确保结果的特异性。
血管形成
血管形成实验（Angiogenesis Assay）是一种用于评估细胞（通常是内皮细胞）在体外形成毛细血管样结构的能力的技术。该实验模拟体内血管生成过程，广泛用于研究肿瘤血管生成、药物筛选、基因功能分析等领域。下面是血管形成实验的基本流程，通常以Matrigel血管生成实验为例。
1.实验设计
• 实验目的：确定特定条件（如药物处理、基因操作、蛋白因子）对内皮细胞血管生成能力的影响。
• 选择细胞系：通常使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs），也可以使用其他类型的内皮细胞系。
• 设置实验组和对照组：包括处理组（如药物处理、基因敲低/过表达）和阴性对照组（无处理或溶剂处理）。
2. Matrigel预处理
• 将Matrigel从-20°C冻存条件下转移到4°C冰箱中过夜解冻。
• 在冰上操作，取出解冻的Matrigel并充分混匀，避免产生气泡。
• 使用预冷的移液器，将合适体积（如96孔板中每孔50 µl，24孔板中每孔100-200 µl）的Matrigel均匀地铺在板孔底部。
• 小心避免气泡的产生，确保Matrigel覆盖均匀。
• 将铺有Matrigel的板置于37°C培养箱中孵育30-60分钟，使其固化。
3. 内皮细胞准备
• 将内皮细胞培养至对数生长期，确保细胞健康。
• 用PBS洗涤细胞两次，消化细胞（如使用胰蛋白酶-EDTA溶液），离心收集。
• 用内皮细胞培养基重悬细胞，并调整细胞密度（通常为2-5 × 10^4个细胞/ml）。
4. 细胞接种
• 轻轻将内皮细胞悬液加入已固化的Matrigel上，每孔加入合适体积（如96孔板中每孔100-200 µl，24孔板中每孔500 µl）。
• 轻轻摇动培养板，使细胞均匀分布在Matrigel表面。
• 将培养板置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育。
5. 药物处理或基因操作
• 按实验设计，将特定药物或基因操作处理加入细胞培养基中。
• 设置对照组（如溶剂处理）和实验组（如特定浓度的药物或基因操作）。
• 药物处理时间通常为6-24小时，具体时间视实验目的和细胞类型而定。
6. 显微镜观察和图像拍摄
• 在不同时间点（如6小时、12小时、24小时）使用倒置显微镜观察细胞的管状结构形成情况。
• 通过显微镜拍摄每个视野下的图像，以记录血管形成的过程和效果。
• 如果使用荧光染料（如Calcein AM）对细胞进行标记，可使用荧光显微镜进行观察，以提高对细胞和管状结构的可视化。
7. 图像分析
• 使用图像分析软件（如ImageJ）测量血管形成的相关指标，如总管长、分支点数量、节点数目等。
• 定量分析各组之间的差异，评估药物或基因操作对血管生成的影响。
原代细胞分离培养
原代培养是指从生物体中取出细胞、组织或器官后立即进行的培养。严格来说，这个过程只涵盖成功传代前的培养阶段，在此阶段，细胞仍保持原有的基本特性。如果是正常的细胞，它们会维持二倍体状态。然而，在实际操作中，原代细胞培养通常是指从第一代到第十代的细胞培养。常用的原代培养方法包括组织块培养和分散细胞培养。
A549
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U-2932
原代细胞培养是一种将细胞直接从生物体中分离并在体外培养的技术。以下是原代细胞培养的基本流程：
1.样本采集
• 从实验动物（如小鼠、大鼠）或人类捐赠者获取新鲜的组织样本。常用的组织包括皮肤、肝脏、肾脏、心脏、骨髓等。
• 在无菌条件下使用手术刀或剪刀将所需的组织取下。
2. 组织处理
• 将样本组织放入冷的生理盐水或培养基中，去除多余的血液和杂质。
• 使用无菌技术将组织切成小块（通常为1-2毫米），以增加酶消化和分散的效率。
3. 组织消化
• 将切碎的组织块放入含有消化酶（如胰蛋白酶、胶原酶）的溶液中，孵育一段时间（30分钟至几小时不等，视组织类型而定），以便将组织分散成单个细胞悬液。
• 定期轻轻搅拌以促进消化。
4. 酶消化终止
• 通过添加含有血清的培养基或使用胰酶抑制剂来终止酶的活性，从而防止过度消化和细胞损伤。
5. 过滤和离心
• 使用细胞过滤器（如70微米的滤网）去除未完全消化的大块组织。
• 将过滤后的细胞悬液离心（如1000 rpm，5分钟）以收集细胞沉淀。
6. 细胞计数与活性检测
• 使用台盼蓝染色法或自动细胞计数仪对细胞进行计数和活力检测，确保细胞数量和活性足够用于培养。
7. 接种细胞
• 将适量的细胞悬液接种到培养皿或培养瓶中。
• 根据细胞类型选择合适的培养基（如DMEM、RPMI-1640）并加入必要的生长因子和补充物（如胎牛血清）。
8. 细胞培养
• 将细胞放入培养箱中（通常设定在37°C，5% CO2）进行培养。
• 定期观察细胞形态、增殖情况，并更换培养基以去除废物和提供新鲜的营养。
9. 传代培养
• 当细胞在培养容器中生长至80-90%汇合时，使用胰蛋白酶消化细胞，将它们转移到新的培养容器中以继续生长。
• 记录传代次数并保持适当的培养条件以维持细胞的健康状态。
10. 细胞保存与库藏
• 为长期保存和后续实验使用，将部分细胞冷冻保存。细胞通常会在含有保护剂（如10% DMSO）的培养基中慢慢冷冻，并储存在液氮中。
通过这些步骤，原代细胞能够从生物体中成功分离和培养，并可用于各种下游的生物医学研究。
