（一）单细胞基因组测序

单细胞基因组测序（single-cell genome sequencing），又称单细胞DNA测序（single-cell DNA sequencing，scDNA-seq），是在单细胞水平上对全基因组进行测序的一项技术。与大量DNA测序不同的是，scDNA-seq可检测到仅存在于少量细胞的DNA特征，具有保真性 [ 8 ]。scDNA-seq可应用于生物体发育与谱系追踪、癌症进展、微生物群多样性的研究 [ 8 ]。

（二）单细胞转录组测序

单细胞转录组测序（single-cell transcriptome sequencing），又称单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），对单细胞mRNA进行基因表达定量、基因功能富集、细胞通讯分析，在研究肿瘤异质性、免疫微环境、早期胚胎发育、神经科学等方面具有优势，可用于理解疾病机制和在细胞水平筛选治疗反应 [ 9 ]。

（三）单细胞表观遗传测序

表观遗传是在不改变基因序列的情况下影响转录的机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA合成。染色质免疫沉淀和测序（ChIP-Seq）可确定DNA结合蛋白的结合位点，是单细胞表观遗传测序的标准方法 [ 10 ]。染色质转座酶可及性测序（ATAC-seq）也可用于研究单细胞表观遗传。另外，还开发一些新的方法来揭示单细胞水平上的表观基因组状态，例如检测染色质可及性单细胞核小体占有与甲基化测序技术（scNOMe-seq），但尚未普及 [ 10 ]。

（四）单细胞空间转录测序

单细胞空间转录测序（single-cell spatial transcriptome sequencing），又称单细胞空间RNA测序（single cell spatial RNA sequencing，spRNA-seq），其没有破坏细胞间的空间结构，可结合批量RNA测序的全局转录分析和原位杂交的优势，显示基因在空间上的表达情况 [ 11 ]。当前的spRNA-seq技术可分为基于成像和基于测序两种，它们优势互补 [ 12 ]。顺序荧光原位杂交可生成空间细胞图谱，促进单细胞生物学研究 [ 12 , 13 ]。该技术可揭示肿瘤进展、生长发育、基因调控的机制。

（五）单细胞多组学测序

随着单细胞技术的发展，单细胞多组学测序（single-cell multi-omics sequencing）应运而生，可整合单细胞基因组、单细胞表观遗传组、单细胞转录组、单细胞蛋白质组、单细胞代谢组、单细胞空间转录组等技术，在生命科学的研究上发挥重要作用 [ 12 ]。这5种单细胞技术的鉴别见表1 。

二、单细胞测序在探索IBD发病机制中的应用

（一）上皮和基质细胞异质性及炎症重塑

上皮屏障破坏是IBD的发病基础，利用单细胞技术可分析肠道上皮异质性和炎症重塑。Smillie等 [ 14 ]对18例UC患者结肠黏膜进行单细胞分析，揭示15个上皮细胞亚群。其中BEST4 +肠细胞作为一种新发现的吸收细胞，其表达可检测pH值的质子通道OTOP2/3 [ 15 ]。另外，研究发现，在肠道炎症时，与碳酸氢盐形成和输出有关的蛋白碳酸酐酶Ⅶ（CA7 ）和BEST4存在分布失调 [ 14 ]。

Li等 [ 16 ]对中国UC患者肠道进行单细胞分析，发现杯状祖细胞、肠细胞及其祖细胞在UC炎症组织中显著减少。杯状细胞对维持黏液层发挥重要作用，而UC的杯状细胞亚群失去一些分泌特征，减少了对黏液层的保护作用 [ 17 ]。另外，M细胞在健康群体少见，但在炎症时数量扩增17倍，并且高度表达CC基序趋化因子配体20（CC motif chemokine ligand 20，CCL20）和CCL23，可募集免疫细胞 [ 14 ]。在结肠中发现Paneth样细胞，可分泌抗菌分子和干细胞维持因子，构建Lgr5 +干细胞的生存微环境 [ 18 ]。有研究发现在CD患者中，结肠上皮细胞分布有明显变化，如位于隐窝底部的Lgr5 +干细胞减少，位于隐窝顶部的成熟结肠细胞增加 [ 19 ]；还重点分析SPIB +细胞（与BEST4 +细胞类似），发现其中一个亚群在CD中显著上调 [ 19 ]。有研究将儿童CD上皮细胞的scRNA-seq图谱与健康组对比分析，发现儿童上皮存在循环BEX5（脑表达X连锁基因5） +上皮前体细胞（不同于成人Lgr5 +干细胞）和胎儿转录因子的激活 [ 20 ]。Maddipatla等 [ 21 ]研究发现上皮细胞亚型比例与疾病进展与治疗有关，尤其是M细胞、簇细胞、杯状细胞、肠细胞和BEST4 +细胞。scRNA-seq也可筛出与肠道屏障修复有关的标记基因，如水通道蛋白8（ AQP8）和磺基转移酶家族1A成员1（ SULT1A1），这些基因为IBD治疗提供新思路 [ 22 ]。

肠间充质细胞在上皮屏障稳态、基质重塑、免疫和炎症调节中起重要作用。Kinchen等 [ 23 ]对IBD结肠间充质细胞进行单细胞分析，揭示除周细胞和肌成纤维细胞外，还有4个成纤维细胞亚群。Smillie等 [ 14 ]对UC结肠进行分析，揭示8个成纤维细胞亚群、4个内皮细胞亚群和1个胶质细胞亚群。在健康人和IBD患者结肠均可检测到大多数成纤维细胞亚群，但其中一个被命名为炎症相关成纤维细胞（inflammation-associated fibroblast，IAF）的亚群在炎性结肠中扩增189倍，且IAF过表达多种与结肠炎、纤维化和癌症相关的基因（如 FAP、TWIST1和 WNT2） [ 14 ]。另外有文献报道CXCL10（C-X-C基序趋化因子配体10） +CCL19 +成纤维细胞和SPARC（分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白） +COL3A1（Ⅲ型胶原蛋白α1链） +成纤维细胞在炎性组织中数量均有增加，可作为慢性炎症疾病包括IBD的治疗靶点。因此，肠间充质细胞尤其是成纤维细胞在肠道炎症时变化显著。

（二）肠道免疫细胞调节

肠道常驻免疫细胞在维持肠道稳态上发挥重要作用，肠道炎症时免疫细胞亚群类型及丰度产生变化。scRNA-seq可分析IBD肠道免疫细胞图谱，有助于进一步理解IBD发病机制。

1．单核巨噬细胞及树突状细胞（dendritic cell，DC）：对IBD患者肠道进行scRNA-seq和空间组学分析发现，除基质细胞外，髓系细胞与患者异质性密切相关 [ 24 ]。髓系细胞可作为肠道黏膜免疫系统的第一道防线，在维持肠道稳态上发挥重要作用。对IBD患者的结肠黏膜绘制图谱，发现与健康人群相比，炎性单核细胞 [ 14 ]、表达磷酸二酯酶4B（PDE4B）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）的巨噬细胞 [ 25 ]均扩增。但UC和CD的结肠黏膜存在区别，UC的HLA-DR（人类白细胞抗原-DR） +CD56 +粒细胞扩增，白细胞介素（interleukin，IL）-1B +DC扩增 [ 26 ]。进一步研究发现UC差异免疫细胞子集为HLA-DR +CD14 +IL-21 +巨噬细胞/单核细胞和HLA-DR +CCR7（CC基序趋化因子受体7） +DC [ 27 ]。scRNA-seq分析揭示UC的关键免疫细胞相关基因，其中膜联蛋白A5（ANXA5）与UC患者巨噬细胞的极化有关 [ 28 ]。对IBD组织中单核细胞、巨噬细胞和DC的独特亚群进行分析，可为IBD个性化治疗提供依据 [ 29 ]。研究发现IL-1B/LYZ（溶菌酶基因） +髓系细胞与UC患者对抗整合素生物疗法耐药有关 [ 30 ]，IL-17B治疗可促进髓系细胞抗炎调节 [ 31 ]，CCL20 +CD14 +单核细胞与CD脂肪爬行有关 [ 32 ]。因此，这些发现促进人们对IBD髓系细胞的理解，为研究潜在治疗靶点提供依据。

2．先天淋巴细胞（innate lymphoid cell，ILC）：ILC位于肠道黏膜组织，是新分类的一种淋巴细胞亚群。ILC不能和T、B细胞一样参与抗原特异性反应，但可针对局部微环境的外部抗原快速做出反应，维持肠道稳态 [ 33 ]。其中能诱导产生2型细胞因子的ILC2发挥主要作用，可与上皮细胞相互作用，调节肠道上皮屏障 [ 33 ]。Xu等 [ 34 ]研究发现ILC2的调节作用与簇细胞表面的L1细胞黏附因子（L1 cell adhesion molecule，L1CAM）和整合素的相互作用有关，反映ILC与上皮细胞的相互作用。除上皮细胞外，神经元信号也可调节ILC [ 35 ]。另外，有文献报道CD患者中ILC1表现出CD诱导基因上调，根据该基因集高度富集的细胞群可继续探究炎症及相关肿瘤的发生机制 [ 36 ]。

3．淋巴细胞：T细胞是肠道免疫中功能最复杂的细胞。scRNA-seq发现IBD患者HLA-DR +CD38 +T细胞增加，UC患者IL-17A +CD161 +效应记忆T细胞和IL-17A +调节性T细胞增加，CD患者IL-1B +HLA-DR +CD38 + T细胞增加，揭示不同的免疫细胞特征 [ 26 ]。利用scRNA-seq发现，UC患者上皮细胞系和免疫细胞系中均观察到Th17衍生活化，说明肠道炎症Th17驱动免疫反应发挥关键作用 [ 16 ]。Medina等 [ 37 ]对IBD患者的CD4 +T细胞的染色质可及性和单细胞转录组综合分析发现，CD4 +T细胞IBD风险位点与致病性Th17细胞风险位点有关。

对CD患者回肠的研究发现，上皮内淋巴细胞存在独特的T细胞亚群，可能与CD透壁炎症存在关联 [ 38 ]。还有研究在CD肠道发现一种新的CD4 +组织驻留记忆T细胞（tissue-resident memory T cell，TRM），可表达促炎的CD161、CCR5和CD103，有助于更好理解CD发病机制 [ 39 ]。

Mann等 [ 40 ]利用scRNA-seq和T细胞受体测序，揭示结肠炎进展和治疗过程中结肠特异性和免疫环境的变化，报告结肠炎不同阶段的T细胞亚群，为探索免疫微环境及结肠炎机制提供依据。

对CD8 +TRM细胞的转录程序及空间分布的分析提示CD8 +细胞在IBD中发挥的作用 [ 41 , 42 ]。scRNA-seq发现UC患者CD8 +IL-17 +T细胞随疾病进展而扩增 [ 14 ]。利用scRNA-seq和抗原受体测序技术观察CD8 +TRM细胞异质性，发现4种不同的转录分化状态，在肠道炎症时CD8 +TRM细胞转向炎症状态 [ 41 ]。对免疫检查点抑制剂诱导结肠炎分析发现，活化的CD8 +TRM细胞表达高水平γ干扰素，可作为一个新的治疗靶点 [ 43 ]。

结肠单细胞分析发现，IBD患者CXCR3（C-X-C基序趋化因子受体3） +浆细胞扩增，活动性CD患者可发现IL-1B +TNF +IFNG +（γ干扰素）幼稚B细胞 [ 26 ]。Li等 [ 16 ]研究中国UC患者结肠黏膜，发现2个新的浆细胞亚群，而炎症区域IgA缺失。Luo等 [ 27 ]进一步研究发现UC患者CXCR3 +CCR4 +naïve B细胞数量扩增，而CD38 +CD27 +浆细胞数量减少。在黏膜愈合过程中，B细胞减少了基质细胞和上皮细胞之间的相互作用，对治疗IBD有一定消极作用 [ 44 ]。

（三）肠道与微生物的相互作用

肠道微生物作为肠道的生物屏障，可维持肠道稳态。单细胞分析揭示肠道微生物与肠道其他细胞的相互作用，有助于理解微生物在调节肠道炎症的作用。Dokoshi等 [ 45 ]经scRNA-seq发现肠道炎症时成纤维细胞分化为前脂肪细胞，可抵御微生物。有研究采用scRNA-seq对CD177 +中性粒细胞耗竭的结肠炎小鼠的肠黏膜进行分析，发现TCR（T细胞受体）γδ +CD8αα +上皮内淋巴细胞扩增，且对微生物群具有高反应性 [ 46 ]。研究发现肠道共生微生物在驱动结肠髓系细胞发育和功能上具有重要作用 [ 47 ]。又有文献报道微生物还可影响结肠簇细胞，从而调节肠道稳态 [ 48 ]。进一步研究发现微生物保守表达的蛋白质即丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）可能参与微生物-宿主相互作用 [ 49 ]。关于肠道对微生物的免疫耐受，Lyu等 [ 50 ]经scRNA-seq发现这与ILC3选择抗原特异性维甲酸相关孤儿核受体γt（RORγt） +调节性T细胞有关。