CHIP实验
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究蛋白质-DNA相互作用的技术。它能够鉴定特定蛋白质（如转录因子或修饰组蛋白）结合的DNA区域，帮助揭示基因调控机制。
以下是ChIP的技术流程及其优点：
ChIP技术路线
1.细胞固定
• 交联蛋白-DNA复合物：用1%甲醛处理活细胞或组织，通常在室温下10分钟，形成共价交联以稳定蛋白-DNA相互作用。
• 终止交联：加入甘氨酸（通常125 mM），中和甲醛，终止交联反应。
2.细胞裂解
• 细胞收集和裂解：将细胞收集后，在冷裂解缓冲液中处理，破碎细胞膜和核膜以释放染色质。
• 染色质片段化：通过超声破碎或微球处理，将染色质剪切成200-1000 bp大小的片段。
3.免疫共沉淀
• 抗体孵育：将染色质溶液与特异性抗体（针对目标蛋白）孵育，通常在4°C下孵育过夜。抗体将结合染色质片段中的目标蛋白。
• 加蛋白A/G磁珠：加入结合抗体的蛋白A或G磁珠，孵育1-2小时，使抗体结合的染色质复合物沉淀。
• 洗涤：用低盐和高盐洗涤缓冲液洗涤磁珠，去除非特异性结合的蛋白质和DNA片段。
4.交联逆转和DNA纯化
• 交联逆转：在65°C下孵育4-6小时以逆转蛋白-DNA的交联，释放DNA。
• 蛋白酶处理：加入蛋白酶K降解蛋白质，通常在37°C孵育1小时。
• DNA纯化：使用酚/氯仿抽提或DNA纯化试剂盒提取并纯化DNA片段。
5.DNA检测
• PCR或qPCR：使用特异性引物对免疫共沉淀的DNA片段进行PCR扩增，以检测目标DNA区域是否与目标蛋白结合。
• 测序（ChIP-seq）：将ChIP DNA片段构建测序文库，并通过高通量测序技术对DNA进行全基因组范围的分析。
6.数据分析
• 结果比较：将ChIP样本与输入DNA（未免疫沉淀的总染色质DNA）进行比较，确定富集区域。
• 生物信息学分析：使用特定软件识别结合位点、分析蛋白-DNA结合模式和潜在调控元件。
ChIP技术优点
1.检测原位蛋白-DNA相互作用：ChIP能够在天然生理状态下研究蛋白质和DNA的相互作用，保留细胞内的真实调控关系。
2.基因调控机制研究：通过ChIP可以分析转录因子、组蛋白修饰、酶等与特定DNA序列的结合，揭示基因调控的分子机制。
3.高灵敏度和特异性：ChIP利用特异性抗体检测特定蛋白质与DNA的结合，能够精确定位结合位点。
4.适用范围广：ChIP可以用于多种细胞类型、组织和动物模型，适用于体内和体外实验。
5.结合测序技术（ChIP-seq）：通过与高通量测序结合，ChIP-seq能够在全基因组范围内鉴定蛋白质-DNA相互作用位点，为基因组调控研究提供大数据支持。
6.动态变化研究：ChIP能够用于研究不同条件下（如药物处理、基因敲除）的蛋白-DNA相互作用变化，揭示动态调控网络。
ELISA检测
酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种基于抗原-抗体特异性结合反应的高灵敏度免疫检测技术，广泛用于蛋白质、抗体、抗原等生物分子的定量分析。
ELISA技术路线
1.样本制备
• 收集样本：可以是血清、血浆、组织培养上清液或其他体液样本。
• 样本稀释：根据样本中目标分子的浓度，进行适当稀释，以确保信号在检测范围内。
2.包被抗原或抗体
• 包被板：将抗原或抗体溶液加入96孔ELISA板，通常每孔100 µl，在4°C孵育过夜或室温孵育1-2小时。包被的抗原或抗体与板表面结合形成固相。
• 洗涤：用洗涤液（如PBS + 0.05% Tween-20）洗涤ELISA板3-5次，以去除未结合的抗原或抗体。
3.封闭
• 封闭步骤：加入封闭液（如5% BSA或脱脂奶粉），在室温孵育1-2小时以封闭未被包被物质占据的板表面，防止非特异性结合。
• 洗涤：再次用洗涤液洗涤板3-5次。
4.加样和孵育
• 加入样本：将稀释后的样本或标准品加入板中，每孔通常100 µl，在37°C或室温下孵育1-2小时，使样本中的抗原与板上的抗体结合，或反之。
• 洗涤：用洗涤液洗涤板3-5次，去除未结合的样本成分。
5.加入检测抗体
• 加酶标记抗体：加入与抗原或抗体特异结合的酶标记二抗（如HRP标记的抗体），每孔100 µl，孵育1小时。
• 洗涤：用洗涤液洗涤板5次，去除未结合的酶标记抗体。
6.显色反应
• 加入底物溶液：加入酶反应底物（如TMB），每孔100 µl，孵育10-30分钟，直到颜色变化达到预期强度。
• 终止反应：加入终止液（如2M H2SO4），每孔50 µl，以稳定显色反应，防止过度反应。
7.数据检测
• 光密度测定：使用酶标仪在特定波长（如450 nm）读取每孔的光吸收值（OD值）。
• 标准曲线：通过标准品OD值建立标准曲线，根据样本的OD值定量目标分子的浓度。
8.数据分析
• 结果计算：根据标准曲线计算样本中目标分子的浓度。
• 数据统计：分析不同实验组和对照组之间的差异。
ELISA技术优点
1.高灵敏度：ELISA能够检测非常低浓度的抗原或抗体，通常可以达到pg/mL的检测范围。
2.高特异性：通过特异性抗体和抗原的结合，ELISA能够准确检测目标分子，非特异性干扰少。
3.定量能力：可精确测量生物分子的浓度，通过标准曲线进行定量分析。
4.高通量：ELISA能够在一个96孔或384孔板上同时检测多个样本，非常适合大规模筛选和临床检测。
5.操作简便：ELISA实验流程简单，易于标准化和自动化，便于临床和实验室广泛应用。
6.多样化：ELISA有多种类型（如直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA），可根据需求灵活选择。
qPCR
实时定量PCR（qPCR），是一种用于检测和定量特定基因表达的分子生物学技术。通过使用荧光染料或特异性荧光探针，在PCR扩增过程中实时监测产物的积累，从而定量分析目标基因的表达水平。
实时检测图
原理图
以下是qPCR的技术路线及其优点：
qPCR技术路线
1.样本准备
• 提取RNA：从组织样本或培养细胞中提取总RNA。常用的方法包括Trizol法或商业RNA提取试剂盒。
• RNA纯化和质量检测：通过紫外分光光度计（如NanoDrop）测定RNA浓度和纯度（A260/A280比值应在1.8-2.0之间），使用琼脂糖凝胶电泳或Bioanalyzer检测RNA完整性。
2.cDNA合成
• 逆转录反应：使用逆转录酶和随机引物或Oligo(dT)引物，将总RNA逆转录成cDNA。反应体系中通常包括RNA模板、逆转录酶、dNTPs、缓冲液和引物。
• 逆转录条件：通常在37-55°C反应30-60分钟，随后在70-75°C下加热5分钟以终止反应。
3.qPCR反应体系准备
• 反应组分：包括cDNA模板、特异性引物对（前向引物和反向引物）、荧光染料（如SYBR Green）或特异性探针、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
• 引物设计：引物应特异性结合目标基因的序列，并尽量避免形成二聚体或发夹结构。引物长度通常为18-22个碱基，退火温度一般在55-65°C。
4.qPCR反应
• 加样：将上述反应组分混合后加入qPCR反应板的孔中（通常为96孔或384孔板），每孔反应体积通常为10-20 µl。
• 热循环条件：
初始变性：95°C，2-5分钟。
循环变性：95°C，10-15秒。
退火/延伸：55-60°C，30-60秒。
重复40个循环。
• 荧光信号检测：在每个循环的退火/延伸步骤末端检测荧光信号，记录Ct值（循环阈值）。
5.数据分析
• 标准曲线法：使用标准样本建立标准曲线，根据未知样本的Ct值定量目标基因的表达水平。
• ΔΔCt法：以参考基因（如GAPDH或β-actin）为内参，通过计算ΔCt和ΔΔCt值，分析目标基因的相对表达变化。
• 数据展示：通过柱状图、折线图等方式展示结果，比较实验组和对照组间的基因表达差异。
qPCR技术优点
1.高灵敏度：qPCR能够检测极低量的核酸样本，通常可以检测到少至10个拷贝的目标序列。
2.高特异性：通过特异性引物和探针，qPCR能够精确区分目标序列和非目标序列。
3.定量能力：qPCR可以实时监测PCR扩增产物的积累，精确测定基因表达水平，并且允许绝对定量和相对定量分析。
4.快速高效：qPCR反应通常在1-2小时内完成，较传统PCR更为快捷。
5.低污染风险：由于qPCR封闭体系和荧光检测方法，减少了样品处理过程中的污染风险。
6.适用范围广：qPCR适用于基因表达分析、基因突变检测、拷贝数变异分析、微生物定量检测等多个领域。
Western blot检测
蛋白质免疫印迹技术（Western Blot，WB）是一种用于检测特定蛋白质的存在和表达量的常规实验技术。它结合了电泳分离、膜转移、抗体检测等步骤，能够定性和定量分析目标蛋白。
WB技术路线
1.样本制备
• 细胞裂解：从组织或细胞中提取蛋白质，使用裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）裂解细胞，并在4°C下震荡30分钟以完全裂解。裂解液中通常包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解和去磷酸化。
• 离心去除碎片：在4°C下12000-14000g离心10-15分钟，收集上清液（蛋白提取液）。
• 测定蛋白浓度：使用BCA法或Bradford法测定蛋白浓度，确保每个样本的蛋白浓度一致。
2.蛋白质电泳
• SDS-PAGE制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶（通常为8-12%），根据蛋白分子量选择合适的凝胶浓度。
• 加样和电泳：将蛋白样本与上样缓冲液混合，加热95°C，5分钟以变性蛋白。将样本上样至凝胶的样品孔中，以90-120 V电压进行电泳，分离蛋白质。
3.转膜
• 转移蛋白：使用半干转或湿转法将蛋白从凝胶转移至PVDF膜或硝酸纤维素膜上，通常在4°C下，100 V电压转移1-2小时。
• 膜封闭：用5%脱脂奶粉或BSA溶液在室温下封闭膜1小时，以阻止非特异性抗体结合。
4.抗体孵育
• 一抗孵育：用特异性的一抗（通常以1:1000-1:5000稀释）在4°C下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间取决于抗体和目标蛋白的特性。
• 洗膜：用TBST（TBS + 0.1% Tween-20）洗膜3次，每次5-10分钟，去除未结合的一抗。
• 二抗孵育：用HRP标记的二抗（通常以1:5000-1:10000稀释）在室温下孵育1小时。
• 洗膜：再次用TBST洗膜3次，每次5-10分钟，去除未结合的二抗。
5.信号检测
• 化学发光检测：在膜上加入ECL发光底物，通过酶促化学发光反应检测蛋白信号。
• 曝光和成像：使用X光胶片或化学发光成像系统记录发光信号，观察特定蛋白带。
6.数据分析
• 条带分析：使用图像分析软件（如ImageJ）分析蛋白条带的强度，对目标蛋白与内参蛋白（如β-actin或GAPDH）的比值进行定量。
• 数据统计：根据实验重复和统计学分析结果，对实验组与对照组之间的蛋白表达差异进行分析。
WB技术优点
1.高特异性：通过使用特异性抗体，WB能够精确检测特定蛋白，即使在复杂的样本背景中也能识别目标蛋白。
2.定性与定量分析：WB不仅能够确认蛋白的存在，还可以定量分析蛋白表达水平的变化。
3.多样性：WB适用于检测各种类型的蛋白，包括细胞膜蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白等。
4.敏感性：化学发光法等灵敏检测技术的应用，使WB能够检测低丰度的蛋白质。
5.分子量确认：电泳分离步骤允许根据分子量判断蛋白质的大小，帮助区分目标蛋白及其可能的不同剪接或修饰形式。
6.多重检测：同一膜上可以进行多重蛋白检测，通过剥膜技术可以重复检测不同蛋白，为研究提供更全面
蛋白免疫共沉淀实验（co-IP）
蛋白质免疫印迹技术（Western Blot，WB）是一种用于检测特定蛋白质的存在和表达量的常规实验技术。它结合了电泳分离、膜转移、抗体检测等步骤，能够定性和定量分析目标蛋白。
WB技术路线
1.样本制备
• 细胞裂解：从组织或细胞中提取蛋白质，使用裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）裂解细胞，并在4°C下震荡30分钟以完全裂解。裂解液中通常包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解和去磷酸化。
• 离心去除碎片：在4°C下12000-14000g离心10-15分钟，收集上清液（蛋白提取液）。
• 测定蛋白浓度：使用BCA法或Bradford法测定蛋白浓度，确保每个样本的蛋白浓度一致。
2.蛋白质电泳
• SDS-PAGE制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶（通常为8-12%），根据蛋白分子量选择合适的凝胶浓度。
• 加样和电泳：将蛋白样本与上样缓冲液混合，加热95°C，5分钟以变性蛋白。将样本上样至凝胶的样品孔中，以90-120 V电压进行电泳，分离蛋白质。
3.转膜
• 转移蛋白：使用半干转或湿转法将蛋白从凝胶转移至PVDF膜或硝酸纤维素膜上，通常在4°C下，100 V电压转移1-2小时。
• 膜封闭：用5%脱脂奶粉或BSA溶液在室温下封闭膜1小时，以阻止非特异性抗体结合。
4.抗体孵育
• 一抗孵育：用特异性的一抗（通常以1:1000-1:5000稀释）在4°C下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间取决于抗体和目标蛋白的特性。
• 洗膜：用TBST（TBS + 0.1% Tween-20）洗膜3次，每次5-10分钟，去除未结合的一抗。
• 二抗孵育：用HRP标记的二抗（通常以1:5000-1:10000稀释）在室温下孵育1小时。
• 洗膜：再次用TBST洗膜3次，每次5-10分钟，去除未结合的二抗。
5.信号检测
• 化学发光检测：在膜上加入ECL发光底物，通过酶促化学发光反应检测蛋白信号。
• 曝光和成像：使用X光胶片或化学发光成像系统记录发光信号，观察特定蛋白带。
6.数据分析
• 条带分析：使用图像分析软件（如ImageJ）分析蛋白条带的强度，对目标蛋白与内参蛋白（如β-actin或GAPDH）的比值进行定量。
• 数据统计：根据实验重复和统计学分析结果，对实验组与对照组之间的蛋白表达差异进行分析。
分子克隆和质粒构建
分子克隆和质粒构建是将特定DNA片段插入到质粒载体中并进行扩增的过程，是基因功能研究、蛋白表达和基因治疗等研究的核心技术。以下是分子克隆和质粒构建的基本流程及其优点：
分子克隆和质粒构建技术路线
1.目的基因片段的获得
• PCR扩增：利用特异性引物从模板DNA中扩增目的基因片段。PCR产物通过电泳检测。
• 限制性内切酶切割：选择合适的限制性内切酶，切割PCR产物和质粒载体，产生相容的粘性末端或平末端。
2.载体和插入片段的连接
• 连接反应：将限制性内切酶处理后的载体与插入片段混合，使用T4 DNA连接酶进行连接反应，构建重组质粒。
3.转化和筛选
• 细菌转化：将重组质粒转化至感受态细菌（如大肠杆菌），通常使用化学方法（如CaCl₂法）或电穿孔法。
• 筛选阳性克隆：将转化细菌涂布于含有抗生素的LB平板上，挑选抗生素抗性菌落。
• 鉴定重组子：通过PCR筛选和限制性酶切分析验证阳性克隆是否含有正确插入的目标基因。
4.质粒提取和验证
• 小量质粒提取：使用质粒提取试剂盒从阳性克隆中提取质粒DNA。
• 测序验证：对提取的质粒进行测序，确认目标基因序列的正确性。
分子克隆和质粒构建技术优点
1.高特异性：通过限制性酶切和连接，可以将特定的DNA片段精确地插入到载体的特定位置。
2.稳定性：质粒在细菌中能够稳定存在并复制，便于长期保存和后续使用。
3.多样性：能够克隆和表达各种类型的基因，适用于基因功能研究、蛋白质表达、突变体构建等多种实验。
4.可扩展性：可以通过不同的载体选择实现各种应用，如报告基因分析、蛋白标签融合、基因敲除等。
5.简单易行：分子克隆技术已经非常成熟，实验流程简便，结果可靠，可在常规分子生物学实验室内完成。
基因组DNA提取
基因组DNA提取是分子生物学实验中的基本步骤，用于从细胞、组织或样本中提取高质量的DNA。此过程通常用于后续的PCR、基因分型、测序和克隆实验。以下是基因组DNA提取的基本流程及其优点：
基因组DNA提取技术路线
1.样本收集
• 组织或细胞收集：可以使用新鲜的组织、细胞培养物、血液、植物样本等。
• 组织粉碎：对于固体组织，使用液氮和研钵进行粉碎，或使用机械组织匀浆器。
2.细胞裂解
• 加入裂解缓冲液：包括SDS或其他去污剂，裂解细胞膜并释放DNA。
• 蛋白酶处理：加入蛋白酶K，在37-56°C下孵育1小时，以降解蛋白质和组蛋白，释放基因组DNA。
3.去除杂质
• RNase处理：加入RNase A以降解RNA，避免RNA污染。
• 酚/氯仿抽提：通过加入等体积的酚/氯仿混合物，涡旋混匀并离心，将蛋白质杂质分离到有机相。
4.DNA沉淀
• 加入乙醇或异丙醇：将上清液转移至新的离心管中，加入2倍体积的冷乙醇或等体积的异丙醇，轻轻混匀以沉淀DNA。
• 离心回收DNA：在4°C、10000g下离心10分钟，收集DNA沉淀。
5.DNA洗涤和溶解
• 洗涤DNA沉淀：用70%乙醇洗涤DNA以去除盐分和杂质。
• 溶解DNA：干燥DNA沉淀后，将其溶解于适量的TE缓冲液或超纯水中。
6.质量和浓度检测
• 光密度测定：使用分光光度计测定260/280 nm比值，评估DNA纯度。
• 电泳检测：通过琼脂糖凝胶电泳确认DNA的完整性。
基因组DNA提取技术优点
1.高纯度和高产量：基因组DNA提取方法能有效去除蛋白质和其他杂质，获得高纯度和高浓度的DNA。
2.适用性广：适用于多种生物样本，包括动物组织、植物组织、微生物、血液等。
3.操作简单：大多数提取方法操作步骤简便，可在常规实验室环境下完成。
4.DNA稳定性好：提取的基因组DNA稳定性高，适合长期保存和下游分子生物学实验应用。
5.自动化兼容：可与自动化提取仪器结合，实现高通量样本处理。
免疫沉淀
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是一种用于从复杂样品中选择性富集和纯化特定蛋白质的技术。IP广泛应用于蛋白质表达水平检测、蛋白质修饰分析和功能研究等领域。以下是IP的技术流程及其优点：
IP技术路线
1.样本制备
• 细胞或组织裂解：用裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）在4°C下裂解细胞或组织样本。缓冲液中应含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂，防止蛋白质降解和去磷酸化。
• 离心去除碎片：在4°C下12000-14000g离心10-15分钟，收集上清液作为蛋白样本。
2.预清除
• 预清除步骤：将蛋白上清液与无抗体的蛋白A/G磁珠或琼脂糖珠在4°C下孵育1小时，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
3.免疫沉淀
• 加入抗体：向预清除的蛋白上清液中加入特异性抗体，通常在4°C下孵育过夜，确保抗体与目标蛋白结合。
• 加入磁珠或琼脂糖珠：添加蛋白A/G磁珠或琼脂糖珠，在4°C下旋转孵育1-2小时，使抗体-蛋白复合物沉淀。
4.洗涤
• 洗涤步骤：用冰冷的洗涤缓冲液洗涤珠子3-5次，每次5分钟，去除未结合的蛋白质和非特异性结合。
5.洗脱和检测
• 洗脱目标蛋白：使用SDS上样缓冲液洗脱珠子上的蛋白质，通常加热95°C，5分钟以变性蛋白质。
• SDS-PAGE和WB检测：通过SDS-PAGE分离洗脱蛋白质，随后进行Western Blot检测，分析目标蛋白的表达和修饰状态。
6.数据分析
• 定量分析：根据Western Blot条带的强度，比较不同实验条件下目标蛋白的表达或修饰差异。
• 特异性验证：通过使用对照抗体（如IgG）或基因敲除细胞系，验证IP的特异性。
IP技术优点
1.高特异性富集目标蛋白：IP能够选择性捕获低丰度目标蛋白质，从复杂样本中富集和纯化特定蛋白。
2.研究蛋白质修饰：IP能够捕获目标蛋白并检测其修饰形式，如磷酸化、乙酰化等，揭示蛋白质的功能状态。
3.灵活性强：IP适用于多种类型的蛋白质和抗体，能够根据实验需求定制实验条件。
4.结合其他技术：IP产物可以进一步用于质谱分析、Western Blot、ELISA等技术，扩展应用范围。
5.适用于体内和体外实验：IP技术既适用于体外培养的细胞样本，也可以用于体内组织样本的分析，广泛应用于不同的生物医学研究。
引物合成
引物合成是根据目标DNA序列设计和合成特异性寡核苷酸的过程，是PCR、测序、克隆等分子生物学实验的基础步骤。以下是引物合成的基本流程及其优点：
引物合成技术路线
1.引物设计
• 序列选择：根据目标基因的序列，设计前向和反向引物，通常长度为18-25个碱基。
• 设计原则：考虑引物的Tm值、GC含量、二级结构和发夹结构的避免，确保特异性结合和高效扩增。
2.在线工具辅助设计
• 使用软件工具：使用在线引物设计工具（如Primer、OLIGO）优化引物序列。
• BLAST比对：通过BLAST比对验证引物的特异性，避免非特异性结合到其他基因。
3.合成引物
• 引物订购：将设计好的引物序列提交给商业合成公司进行合成。公司通常提供脱盐纯化的引物。
• 引物纯化：若有需求，可选择进一步的PAGE或HPLC纯化以获得高纯度引物。
4.引物溶解
• 引物溶解和稀释：将干燥的引物溶解在无RNase、DNase的无菌水中，制备工作浓度（通常为10-20 μM）的引物储备液。
5.引物验证
• PCR扩增测试：使用合成的引物进行PCR扩增测试，验证其扩增效率和特异性。
• 电泳检测：通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物大小和条带强度。
引物合成技术优点
1.高特异性：通过精心设计和在线工具优化，引物可以专一性识别目标序列，减少非特异性扩增。
2.快速合成：现代合成技术能够快速、大规模地生产高质量引物，满足科研和临床需求。
3.灵活性强：引物长度和序列可以根据实验需求定制，适用于各种分子生物学实验，如qPCR、测序和克隆。
4.高效性：优化的引物具有高扩增效率，保证了PCR反应的灵敏度和准确性。
5.广泛应用：合成引物技术适用于基因检测、病原体检测、基因表达分析、基因编辑等广泛应用领域。
总RNA提取
总RNA提取是从细胞或组织样本中分离高质量RNA的重要步骤，用于后续的RT-qPCR、RNA-Seq和Northern blot等分析。以下是总RNA提取的基本流程及其优点：
总RNA提取技术路线
1.样本收集和裂解
• 新鲜样本或冻存样本：收集新鲜组织或细胞样本，或使用液氮快速冷冻样本。
• 加入裂解缓冲液：使用含有胍盐（如胍硫氰酸盐）的裂解缓冲液裂解细胞，抑制RNase酶的活性，保持RNA完整性。
2.去除蛋白质和脂质
• 酚/氯仿抽提：加入等体积的酚/氯仿混合物，涡旋混匀并离心，分离蛋白质和脂质到有机相。水相保留RNA。
3.RNA沉淀
• 加入异丙醇：将水相转移到新的离心管中，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，混匀并在4°C下孵育10分钟。
• 离心回收RNA：在4°C、12000g条件下离心10-15分钟，收集RNA沉淀。
4.RNA洗涤和溶解
• 70%乙醇洗涤：用70%冷乙醇洗涤RNA沉淀，以去除盐分和杂质。
• 溶解RNA：干燥RNA沉淀后，用适量的RNase-free水或TE缓冲液溶解RNA。
5.RNA质量和浓度检测
• 光密度测定：使用分光光度计测定260/280 nm比值，评估RNA纯度。
• 电泳检测：通过琼脂糖凝胶电泳确认RNA的完整性（rRNA条带清晰无降解）。
总RNA提取技术优点
1.高完整性和高纯度：提取步骤可以有效去除DNA、蛋白质和脂质，获得高质量的RNA，适合精密分子生物学分析。
2.RNase抑制：提取过程中使用RNase抑制剂，防止RNA降解，保证RNA的完整性。
3.广泛适用：适用于各种类型的生物样本，包括动物、植物、细菌和真菌。
4.高产量：能够从少量样本中提取足够的RNA用于多种下游分析。
5.快速高效：常规实验室条件下可以快速完成，总RNA提取耗时较短。
