H&E染色
H&E染色（Hematoxylin and Eosin Staining）是最常用的组织学染色方法，用于区分细胞核和细胞质成分，广泛应用于组织切片的病理学和诊断研究。
H&E染色技术路线
1.样本准备
切片：将石蜡包埋的组织切片至3-5 μm厚度。
脱蜡和再水化：切片经过二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水至水。
2.苏木精染色
苏木精染色：将切片浸入苏木精染色液中5-10分钟，染色细胞核。
冲洗：用自来水冲洗，去除多余染液。
蓝化：用碱性溶液（如氨水）处理切片数秒钟，使苏木精染色的细胞核显现出蓝色。
3.伊红染色
伊红染色：将切片浸入伊红染色液中1-2分钟，染色细胞质和细胞外基质。
冲洗：用自来水快速冲洗，去除多余染液。
4.脱水和透明化
脱水：将切片通过梯度乙醇脱水，最后在100%乙醇中脱水。
透明化：使用二甲苯透明化切片，以增加透明度。
5.封片
封片：用中性树胶封片剂封片，以保护染色切片。
6.观察
显微镜观察：在光学显微镜下观察染色结果，细胞核呈蓝紫色，细胞质呈粉红色。
H&E染色技术优点
操作简便：步骤简单，成本低，适合大批量样本染色。
组织结构清晰：细胞核、细胞质和细胞外基质的染色差异明显，便于组织结构的观察和分析。
广泛应用：适用于各种组织类型的形态学研究，尤其在病理诊断中具有重要作用。
结果直观：染色结果直观清晰，易于通过光学显微镜直接观察和记录。
与其他技术兼容：H&E染色切片可用于后续的特殊染色、免疫组化或分子检测。
冰冻切片
冰冻切片（Cryosectioning）是将组织样本在冷冻状态下快速切片的方法，用于组织学和分子生物学分析。此技术常用于免疫组化、免疫荧光、核酸杂交和其他染色技术。
冰冻切片技术路线
1.组织取材与处理
• 样本采集：取新鲜组织样本，尽可能避免污染和损伤。
• 固定（可选）：若需固定，使用4%多聚甲醛溶液固定10-30分钟（视组织类型而定），然后用PBS漂洗去除固定剂。
• 预冷：将组织样本放在冷冻切片机（cryostat）内预冷10-15分钟。
2.包埋与冷冻
• 包埋：将组织放在含有OCT（Optimal Cutting Temperature compound）包埋剂的模具中。
• 快速冷冻：将包埋好的模具浸入液氮或干冰丙酮混合物中，快速冷冻以防止冰晶形成，保持组织结构。
3.切片
• 切片温度设定：在冷冻切片机中，设定适合的温度（通常为-20°C至-30°C）。
• 切片厚度：选择合适的切片厚度（通常为5-10 μm），将组织切片。
• 贴片：将切下的组织片用刷子或镊子轻轻移至载玻片上。
4.干燥和储存
• 快速干燥：将载玻片置于室温下或干燥箱内几分钟以干燥切片。
• 储存：切片可立即用于染色或短期内储存在-20°C下用于后续分析。
冰冻切片技术优点
1.快速高效：无需长时间固定和脱水处理，快速制备和分析，适合临床快速诊断和即时分析。
2.保护抗原性：由于固定时间短或无需固定，组织抗原性和酶活性更好地保留，适合免疫组化和免疫荧光实验。
3.结构保存良好：冷冻切片避免了传统石蜡切片中的高温处理，组织结构保存更加真实。
4.适用于脂质和糖原：脂质和糖原在冷冻切片中不被提取，适合脂肪组织或糖原的研究。
5.多用途性：冰冻切片可用于多种染色技术，包括H&E染色、酶组织化学、免疫组化和荧光染色。
骨组织脱钙
骨组织脱钙是将钙离子从骨组织中去除的过程，使其柔软，便于切片和组织学分析。常用于研究骨组织结构、细胞成分和病理状态。
骨组织脱钙技术路线
1.样本固定
• 收集骨组织：将骨组织用4%多聚甲醛固定24-48小时，防止组织降解。
• 漂洗：用PBS漂洗去除固定剂。
2.脱钙
• 脱钙剂选择：常用EDTA溶液（pH 7.4）或10%甲酸溶液进行脱钙。EDTA脱钙较为缓慢，但保留组织细胞和抗原性较好；甲酸脱钙较快，但可能损伤组织。
• 脱钙时间：根据骨的大小和厚度，脱钙时间为几天至几周。使用EDTA时，通常需要2-4周。
• 溶液更换：定期更换脱钙溶液以确保脱钙效果。
• 检测脱钙完成：使用针刺或X射线检测骨的软化程度，确保脱钙完成。
3.组织处理
• 漂洗和脱水：脱钙完成后，用PBS漂洗，逐级乙醇脱水。
• 透明化和包埋：用二甲苯透明化，然后在石蜡中包埋。
4.切片和染色
• 切片：使用微切片机将石蜡包埋的骨组织切成5-7 μm厚的切片。
• H&E染色或其他染色：进行常规组织学染色或特殊染色。
骨组织脱钙技术优点
1.便于切片：脱钙使骨组织柔软，易于使用常规微切片机切片，适合后续组织学分析。
2.结构和细胞成分的保留：适当的脱钙条件能很好地保留骨组织的细胞成分和组织结构。
3.广泛应用：适用于病理诊断、组织学研究、骨发育研究及骨病变的研究。
4.多种脱钙剂选择：可根据研究需要选择不同的脱钙剂（如EDTA和酸性脱钙剂），灵活性高。
5.抗原性保存：使用温和脱钙剂如EDTA，有助于保留抗原性，适合免疫组化分析。
免疫组化
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是通过抗体特异性结合组织切片中的抗原来检测蛋白表达和分布的技术。广泛应用于基础研究、临床诊断和病理分析。
免疫组化技术路线
1.样本准备
• 固定和切片：使用4%多聚甲醛固定组织，进行石蜡包埋和切片（3-5 μm）。
• 脱蜡和再水化：将石蜡切片脱蜡，经过梯度乙醇再水化至水。
2.抗原修复
• 热修复：使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 8.0）在微波炉或高压锅中进行热修复，破坏交联结构，暴露抗原位点。
• 酶修复：对于某些抗原，使用蛋白酶K或胰蛋白酶消化以暴露抗原。
3.封闭
• 封闭非特异性结合位点：使用5%-10%山羊血清或牛血清白蛋白（BSA）封闭切片，防止非特异性抗体结合。
4.抗体孵育
• 一抗孵育：将切片与特异性的一抗孵育1-2小时（室温）或过夜（4°C）。
• 洗涤：使用PBS或TBS洗涤去除未结合的一抗。
5.二抗孵育
• 二抗孵育：用HRP标记的二抗或荧光标记二抗孵育30-60分钟。
• 洗涤：再次用PBS或TBS洗涤。
6.信号检测和显色
• DAB显色：使用DAB显色剂，孵育数分钟直至出现棕色信号。
• 对比染色：使用苏木素进行细胞核染色。
7.封片和观察
• 脱水和封片：切片通过梯度乙醇脱水，二甲苯透明化，并封片。
• 显微镜观察：在光学显微镜下观察和拍照记录。
免疫组化技术优点
1.定位准确：能够直接在组织切片中定位和定量蛋白表达，提供组织特异性表达信息。
2.应用广泛：适用于各种类型的组织和细胞，广泛用于基础研究和临床病理诊断。
3.高灵敏度：通过信号放大技术，如使用酶标二抗，显著提高检测灵敏度。
4.结果直观：染色结果直观，易于通过显微镜直接观察并记录。
5.多重染色：可以在同一组织切片上检测多种蛋白，通过不同的标记和染色方法实现多重分析。
免疫荧光
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）是通过荧光标记的抗体检测组织或细胞中目标蛋白分布和表达的技术。常用于研究蛋白定位、细胞信号通路和组织结构。
免疫荧光技术路线
1.样本准备
• 固定和切片：组织样本用4%多聚甲醛固定，进行冰冻切片（5-10 μm）或细胞培养固定。
• 透化（如需）：使用0.1%-0.5% Triton X-100透化细胞膜，暴露细胞内抗原。
2.封闭
• 封闭非特异性结合：用5%-10% BSA或山羊血清封闭切片或细胞，以减少背景染色。
3.抗体孵育
• 一抗孵育：将样本与特异性一抗孵育1-2小时（室温）或过夜（4°C）。
• 洗涤：用PBS洗涤，去除未结合的一抗。
4.二抗孵育
• 荧光二抗孵育：使用荧光标记的二抗（如FITC、Alexa Fluor系列），孵育30-60分钟。
• 洗涤：再次用PBS洗涤。
5.核染（可选）
• DAPI染色：若需核染，使用DAPI或Hoechst 33342染色细胞核。
6.封片和观察
• 封片：用抗荧光淬灭封片剂封片，以减少荧光信号衰减。
• 显微镜观察：使用荧光显微镜观察和拍照，分析荧光信号。
免疫荧光技术优点
1.高特异性和灵敏度：使用荧光标记的抗体，可以实现特异性高、背景低的蛋白检测。
2.多重标记能力：可以同时检测多种蛋白，通过不同荧光染料区分。
3.空间分辨率高：能够在单细胞或亚细胞水平上观察蛋白定位和分布。
4.实时观察：适用于活细胞或组织的动态观察，分析蛋白在细胞过程中的变化。
5.定量分析：通过荧光强度的测量，可以进行半定量或定量分析。
扫描电镜
扫描电镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）是通过扫描电子束来成像样本表面形貌的技术，广泛用于材料科学和生物学研究。
扫描电镜技术路线
1.样本准备
• 固定：将生物样本用2.5%戊二醛固定数小时至过夜，维持细胞结构。
• 冲洗：使用PBS缓冲液冲洗去除固定剂残留。
• 二次固定（可选）：用1%锇酸进一步固定，增强样本的电导性和结构稳定性。
2.脱水
• 梯度乙醇脱水：逐步增加乙醇浓度（30%-100%），每步10-15分钟，最后在100%乙醇中脱水数次。
• 临界点干燥：使用CO₂临界点干燥法，避免表面张力导致样本结构损坏。
3.镀金
• 导电处理：将样本表面镀上一层薄金膜或碳膜，提高样本导电性，减少电子束积累和电荷积累。
4.观察和成像
• 安装样本：将处理好的样本安装在样本台上，放入SEM腔体中。
• 调节参数：设置加速电压、工作距离等参数，调整电子束焦点。
• 成像和拍照：通过扫描电子束观察样本表面形貌，获取高分辨率图像。
扫描电镜技术优点
1.高分辨率：SEM提供纳米级别的表面成像能力，适合细胞表面微观结构和组织形态学研究。
2.立体成像：能获得样本表面的三维形貌信息，适合研究样本的表面特征和形态。
3.样本范围广：适用于生物样本、材料科学样本等多种类型样本的成像分析。
4.多功能性：可进行元素分析、成分分析（EDX）等多种扩展实验。
5.图像质量高：提供高对比度和清晰度的图像，有助于精确的形态学分析。
透射电镜
透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）用于观察超薄样本的内部结构，适合细胞、组织和纳米材料的超微结构研究。
透射电镜技术路线
1.样本固定
• 初步固定：用2.5%戊二醛在4°C固定样本数小时至过夜。
• 冲洗：用PBS或其他缓冲液冲洗去除固定剂。
• 二次固定：用1%锇酸固定1-2小时，提高样本的电导性和结构稳定性。
2.脱水
• 梯度乙醇脱水：逐步增加乙醇浓度，最后在100%乙醇中完全脱水。
3.包埋
• 渗透和包埋：用环氧树脂渗透样本，使其硬化和稳定，适合超薄切片。
• 聚合：将包埋样本在60°C下聚合数小时至过夜。
4.超薄切片
• 切片：使用超薄切片机将包埋样本切成50-70 nm的超薄切片。
• 上网和染色：将切片放在铜网上，用醋酸铀和柠檬酸铅染色以增加对比度。
5.观察和成像
• 样本加载：将染色好的样本网安装在TEM样本台上，放入TEM腔体中。
• 调整参数：设置加速电压、光圈和透镜电流，调整电子束焦点。
• 成像和拍照：通过电子束透射样本，获取内部超微结构图像。
透射电镜技术优点
1.超高分辨率：TEM能够达到原子级分辨率，适合观察细胞、病毒和纳米材料的超微结构。
2.内部结构成像：可以观察样本内部的详细结构，包括细胞器、病毒颗粒、纳米材料等。
3.对比增强：通过染色提高样本的电子密度差异，获得高对比度图像。
4.元素分析：可结合能谱分析（EDS）进行元素分布分析。
5.研究多样性：适用于生物学、材料科学、纳米技术等领域的超微结构研究。
